Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System

清脆的 基因组编辑 生物 Cas9 人类基因组 表型 质粒 基因组工程 遗传学 计算生物学 基因 细胞培养 基因组 干细胞
作者
Benjamin Grobarczyk,Bénédicte Franco,Kevin Hanon,Brigitte Malgrange
出处
期刊:Stem Cell Reviews and Reports [Springer Nature]
卷期号:11 (5): 774-787 被引量:68
标识
DOI:10.1007/s12015-015-9600-1
摘要

Genome engineering and human iPS cells are two powerful technologies, which can be combined to highlight phenotypic differences and identify pathological mechanisms of complex diseases by providing isogenic cellular material. However, very few data are available regarding precise gene correction in human iPS cells. Here, we describe an optimized stepwise protocol to deliver CRISPR/Cas9 plasmids in human iPS cells. We highlight technical issues especially those associated to human stem cell culture and to the correction of a point mutation to obtain isogenic iPS cell line, without inserting any resistance cassette. Based on a two-steps clonal isolation protocol (mechanical picking followed by enzymatic dissociation), we succeed to select and expand corrected human iPS cell line with a great efficiency (more than 2 % of the sequenced colonies). This protocol can also be used to obtain knock-out cell line from healthy iPS cell line by the NHEJ pathway (with about 15 % efficiency) and reproduce disease phenotype. In addition, we also provide protocols for functional validation tests after every critical step.
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