Effect of different experimental conditions on the in vitro transformation efficiency for Neisseria gonorrhoeae

摘要: 【摘要】 目的 探讨不同实验条件对淋病奈瑟球菌(淋球菌)体外转化效率的影响。 方法 以淋球菌D株DNA为模板扩增penA基因,采用重叠延伸PCR制备penAA501V(耐药突变)基因,购买淋球菌penAH041基因(耐药阳性对照)。制备含penA/penAA501V/penAH041基因的质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,采用蓝白筛选培养基克隆扩增;分别采用日本TaKaRa公司质粒提取试剂盒和天根生化科技(北京)有限公司高纯度质粒小提试剂盒提取质粒。以penA质粒、penAA501V质粒、penAH041质粒、penAA501V基因、penAH041基因为底物采用直接孵育法转化淋球菌受体菌株A43、A49,测定转化率(CFU/μg)及头孢曲松(CRO)的最小抑菌浓度(MIC)。以penAA501V、penAH041基因为底物,采用脂质体法转化受体菌株A43、A49,观察转化效率及头孢曲松的MIC。结果 以D株淋球菌DNA为模板,成功获得1 749 bp的penA及penAA501V基因。提取质粒并电泳后,TaKaRa试剂盒提取的含淋球菌penA、penAA501V、penAH041基因的质粒主要集中在2 500 bp处,迁移速度较快;天根试剂盒提取的质粒主要集中在5 000 bp处,迁移速度较慢。直接孵育法转化时,含野生型penA的A43株的MIC为0.001 μg/ml,转入penA质粒后MIC上升至0.002 μg/ml,转入penAA501V质粒和penAA501V基因转化株MIC均为0.004 μg/ml,转入阳性对照penAH041质粒和penAH041基因后MIC均升至0.512 μg/ml;各底物孵育后CRO对A49株的MIC值与空白对照相同,均为0.016 μg/ml。脂质体法转化时,含野生型penA的A43株对CRO的MIC是0.002 μg/ml,A49株MIC为0.016 μg/ml;penAA501V基因转化A43株后MIC升至0.004 μg/ml,转化A49株后仍为0.016 μg/ml;阳性对照penAH041基因转化A43和A49株后MIC均升至0.250 μg/ml,较空白对照分别升高至125倍和15.6倍。结论 选择质粒为底物采用直接孵育法对A43株淋球菌有较好转化效率,不同质粒提取方法可能影响转化效率,对于直接孵育法转化效率不高的A49株可采用脂质体法。