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Generation and characterization of new highly thermostable and processive M-MuLV reverse transcriptase variants

过程性 逆转录酶 互补DNA 突变体 定向进化 生物 分子生物学 点突变 小鼠白血病病毒 热稳定性 核糖核酸 聚合酶 遗传学 生物化学 病毒 基因
作者
A. Baranauskas,S. Paliksa,Gediminas Alzbutas,M. Vaitkevicius,Judita Lubiene,V. Letukiene,S. Burinskas,Giedrius Sasnauskas,Remigijus Skirgaila
出处
期刊:Protein Engineering Design & Selection [Oxford University Press]
卷期号:25 (10): 657-668 被引量:72
标识
DOI:10.1093/protein/gzs034
摘要

In vitro synthesis of cDNA is one of the most important techniques in present molecular biology. Faithful synthesis of long cDNA on highly structured RNA templates requires thermostable and processive reverse transcriptases. In a recent attempt to increase the thermostability of the wt Moloney Murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MuLV RT), we have employed the compartmentalized ribosome display (CRD) evolution in vitro technique and identified a large set of previously unknown mutations that enabled cDNA synthesis at elevated temperatures. In this study, we have characterized a group of the M-MuLV RT variants (28 novel amino acid positions, 84 point mutants) carrying the individual mutations. The performance of point mutants (thermal inactivation rate, substrate-binding affinity and processivity) correlated remarkably well with the mutation selection frequency in the CRD experiment. By combining the best-performing mutations D200N, L603W, T330P, L139P and E607K, we have generated highly processive and thermostable multiply-mutated M-MuLV RT variants. The processivity of the best-performing multiple mutant increased to 1500 nt (65-fold improvement in comparison to the wt enzyme), and the maximum temperature of the full-length 7.5-kb cDNA synthesis was raised to 62°C (17° higher in comparison with the wt enzyme).
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