Quantification of Small Molecule–Protein Interactions using FRET between Tryptophan and the Pacific Blue Fluorophore

荧光团 费斯特共振能量转移 化学 色氨酸 等温滴定量热法 荧光 小分子 离解常数 生命科学中的荧光 配体(生物化学) 氨基酸 生物化学 量子力学 物理 受体
作者
Molly M. Lee,Blake R. Peterson
出处
期刊:ACS omega [American Chemical Society]
卷期号:1 (6): 1266-1276 被引量:30
标识
DOI:10.1021/acsomega.6b00356
摘要

We report a new method to quantify the affinity of small molecules for proteins. This method is based on Förster resonance energy transfer (FRET) between endogenous tryptophan (Trp) residues and the coumarin-derived fluorophore Pacific Blue (PB). Tryptophan residues are frequently found in proteins near ligand-binding sites, making this approach potentially applicable to a wide range of systems. To improve access to PB, we developed a scalable multigram synthesis of this fluorophore, starting with inexpensive 2,3,4,5-tetrafluorobenzoic acid. This route was used to synthesize fluorescent derivatives of biotin, as well as lower affinity thiobiotin, iminobiotin, and imidazolidinethione analogues that bind the protein streptavidin. Compared with previously published FRET acceptors for tryptophan, PB proved to be superior in both sensitivity and efficiency. These unique properties of PB enabled direct quantification of dissociation constants (Kd) as well as competitive inhibition constants (Ki) in the micromolar to nanomolar range. In comparison to analogous binding studies using fluorescence polarization, fluorescence quenching, or fluorescence enhancement, affinities determined using Trp-FRET were more precise and accurate as validated using independent isothermal titration calorimetry studies. FRET between tryptophan and PB represents a new tool for the characterization of protein-ligand complexes.
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