Iterative crRNA design and a PAM-free strategy enabled an ultra-specific RPA-CRISPR/Cas12a detection platform

反式激活crRNA 清脆的 计算生物学 计算机科学 化学 生物 基因组编辑 生物化学 基因
作者
Xujian Mao,Jian Xu,Jingyi Jiang,Qiong Li,Ping Yao,J. C. Jiang,Li Gong,Dong Yin,Bowen Tu,Rong Wang,Haoqi Tang,Fang Yao,Wang Feng-ming
出处
期刊:Communications biology [Springer Nature]
卷期号:7 (1) 被引量:1
标识
DOI:10.1038/s42003-024-07173-7
摘要

CRISPR/Cas12a is a highly promising detection tool. However, detecting single nucleotide variations (SNVs) remains challenging. Here, we elucidate Cas12a specificity through crRNA engineering and profiling of single- and double-base mismatch tolerance across three targets. Our findings indicate that Cas12a specificity depends on the number, type, location, and distance of mismatches within the R-loop. We also find that introducing a wobble base pair at position 14 of the R-loop does not affect the free energy change when the spacer length is truncated to 17 bp. Therefore, we develop a new universal specificity enhancement strategy via iterative crRNA design, involving truncated spacers and a wobble base pair at position 14 of the R-loop, which tremendously increases specificity without sacrificing sensitivity. Additionally, we construct a PAM-free one-pot detection platform for SARS-CoV-2 variants, which effectively distinguishes SNV targets across various GC contents. In summary, our work reveals new insights into the specificity mechanism of Cas12a and demonstrates significant potential for in vitro diagnostics. A new ultra-specific enhancement strategy for Cas12a via iterative crRNA design. A PAM-free one-pot detection platform for SARS-CoV-2 variants demonstrates significant potential for in vitro diagnostics.
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