Asymmetric exponential amplification reaction on a toehold/biotin featured template: an ultrasensitive and specific strategy for isothermal microRNAs analysis

生物 环介导等温扩增 检出限 小RNA 宽动态范围 底漆延伸 DNA 生物系统 计算生物学 寡核苷酸 基序列 生物化学 色谱法 计算机科学 化学 基因 计算机视觉
作者
Jun Chen,Xueqing Zhou,Yingjun Ma,Xiulian Lin,Zong Dai,Xiaoyong Zou
出处
期刊:Nucleic Acids Research [Oxford University Press]
卷期号:: gkw504-gkw504 被引量:55
标识
DOI:10.1093/nar/gkw504
摘要

The sensitive and specific analysis of microRNAs (miRNAs) without using a thermal cycler instrument is significant and would greatly facilitate biological research and disease diagnostics. Although exponential amplification reaction (EXPAR) is the most attractive strategy for the isothermal analysis of miRNAs, its intrinsic limitations of detection efficiency and inevitable non-specific amplification critically restrict its use in analytical sensitivity and specificity. Here, we present a novel asymmetric EXPAR based on a new biotin/toehold featured template. A biotin tag was used to reduce the melting temperature of the primer/template duplex at the 5′ terminus of the template, and a toehold exchange structure acted as a filter to suppress the non-specific trigger of EXPAR. The asymmetric EXPAR exhibited great improvements in amplification efficiency and specificity as well as a dramatic extension of dynamic range. The limit of detection for the let-7a analysis was decreased to 6.02 copies (0.01 zmol), and the dynamic range was extended to 10 orders of magnitude. The strategy enabled the sensitive and accurate analysis of let-7a miRNA in human cancer tissues with clearly better precision than both standard EXPAR and RT-qPCR. Asymmetric EXPAR is expected to have an important impact on the development of simple and rapid molecular diagnostic applications for short oligonucleotides.
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