Recherche de cytochromes P450 impliqués dans la tolérance aux herbicides chez le blé (Triticum aestivum)

Les cytochromes P450 sont des hemoproteines impliquees dans un grand nombre de reactions d'hydroxylation et egalement connues pour la detoxification d'herbicides. Il a ete montre que le ble est capable de metaboliser un grand nombre d'herbicide grâce a des P450s. Notre objectif fut d'isoler et d'exprimer dans la levure les P450s de ble les plus pertinents pour predire le metabolisme des herbicides et de molecule en developpement. Peu de sequences etaient disponibles lorsque ce travail fut initie. Nous avons teste differentes approches basee sur la PCR pour isoler de nouvelles sequences de P450s. Le mRNA differential display , le sequencage d'ESTs et la conception classique d'amorce de PCR furent moins efficaces qu'une nouvelle methode appelee CODEHOP. Cette derniere permit d'isoler plus de 100 sequences de P450 qui correspondent a plus de 50 P450s differents. 28 sequences furent choisies pour etre isolees puis exprimees dans la levure. En raison d'une difference dans l'utilisation des codons entre la levure et le ble, une optimisation consistant en un recodage de l'extremite 5' des sequences de ble fut necessaire en utilisant pour cette region les codons les plus utilises de la levure. Ces P450s furent testes pour leur capacite a metaboliser un groupe representatif d'herbicide et plusieurs substrats physiologiques potentiels. Le resultat du criblage realise sur les herbicides fut negatif, mais plusieurs substrats physiologiques furent identifies ou confirmes. Parmi eux, les cytochromes impliques dans la biosynthese d'une phytoalexine (DIMBOA) et de la linamarine et lotaustraline furent identifies. Pour la famille CYP709, une nouvelle fonction d'hydroxylation d'acide gras fut attribuee. Nous avons egalement pu identifier trois P450s impliques dans l'hydroxylation en 3' des composes de la voie des phenylpropanoides. Plusieurs nouvelles activites secondaires pour ce groupe d'enzyme furent identifiees.