慢病毒载体介导的自杀基因系统YCD／5-FC对人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞杀伤效应的研究

背景与目的：酵母菌胞嘧啶脱氨酶（yeast cytosine deaminase，YCD）可将无毒性的抗真菌药5氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-FC）转化为细胞毒性产物氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），进而阻抑DNA、RNA和蛋白质合成，引起细胞死亡。本研究中构建含YCD基因的慢病毒载体质粒，体内外观察YCD／5-FC自杀基因系统的杀伤效应。方法：应用亚克隆技术将YCD和绿色荧光蛋白基因（green fluorescence protein，GFP）连接至慢病毒空载体pFUW，构建获得pGCFU—YCD—GFP。将3质粒系统（含包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒）脂质体法共转染包装细胞293T，获得的慢病毒转染人Jurkat细胞，流式细胞仪（FACS）和Westernblot检测Jurkat／YCD-GFP表达水平；加入前体药物5-FC，观察对靶细胞的杀伤情况和旁观者效应。转基因细胞接种至裸鼠前肢皮下，观察体内肿瘤杀伤情况。结果：慢病毒载体3质粒系统感染293T细胞后，获得的慢病毒滴度为1．2×10^8TU／mL。该病毒可高效转染人Jurkat细胞，感染率达96．93％，Western blot显示转基因细胞可分泌YCD蛋白。100umol／L5-FC作用96h可杀伤（89．37±6．57）％的Jurkat／YCD—GFP细胞。混合培养提示存在明显的旁观者效应。转基因细胞可在小鼠体内致瘤，5-FC可明显抑制肿瘤生长。结论：成功构建慢病毒载体pGC—FU—YCD—GFP，YCD／5-FC自杀基因系统在体内外均有显著的特异性杀伤效应。