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Real-time visualization of titin dynamics reveals extensive reversible photobleaching in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

提丁 光漂白后的荧光恢复 光漂白 肌节 生物物理学 默默林 化学 细胞生物学 荧光显微镜 生物 生物化学 心肌细胞 荧光 物理 量子力学
作者
Adrian G. Cadar,Tromondae K. Feaster,Kevin Bersell,Lili Wang,TingTing Hong,Joseph A. Balsamo,Zhentao Zhang,Young Wook Chun,Young‐Jae Nam,Michael Gotthardt,Björn C. Knollmann,Dan M. Roden,Chee Chew Lim,Charles C. Hong
出处
期刊:American Journal of Physiology-cell Physiology [American Physical Society]
卷期号:318 (1): C163-C173 被引量:9
标识
DOI:10.1152/ajpcell.00107.2019
摘要

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) has been useful in delineating cardiac myofilament biology, and innovations in fluorophore chemistry have expanded the array of microscopic assays used. However, one assumption in FRAP is the irreversible photobleaching of fluorescent proteins after laser excitation. Here we demonstrate reversible photobleaching regarding the photoconvertible fluorescent protein mEos3.2. We used CRISPR/Cas9 genome editing in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to knock-in mEos3.2 into the COOH terminus of titin to visualize sarcomeric titin incorporation and turnover. Upon cardiac induction, the titin-mEos3.2 fusion protein is expressed and integrated in the sarcomeres of hiPSC-derived cardiomyocytes (CMs). STORM imaging shows M-band clustered regions of bound titin-mEos3.2 with few soluble titin-mEos3.2 molecules. FRAP revealed a baseline titin-mEos3.2 fluorescence recovery of 68% and half-life of ~1.2 h, suggesting a rapid exchange of sarcomeric titin with soluble titin. However, paraformaldehyde-fixed and permeabilized titin-mEos3.2 hiPSC-CMs surprisingly revealed a 55% fluorescence recovery. Whole cell FRAP analysis in paraformaldehyde-fixed, cycloheximide-treated, and untreated titin-mEos3.2 hiPSC-CMs displayed no significant differences in fluorescence recovery. FRAP in fixed HEK 293T expressing cytosolic mEos3.2 demonstrates a 58% fluorescence recovery. These data suggest that titin-mEos3.2 is subject to reversible photobleaching following FRAP. Using a mouse titin-eGFP model, we demonstrate that no reversible photobleaching occurs. Our results reveal that reversible photobleaching accounts for the majority of titin recovery in the titin-mEos3.2 hiPSC-CM model and should warrant as a caution in the extrapolation of reliable FRAP data from specific fluorescent proteins in long-term cell imaging.
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