General Strategy To Improve the Photon Budget of Thiol-Conjugated Cyanine Dyes

化学 马来酰亚胺 生物结合 光漂白 光化学 荧光团 硫醇 分子 荧光 组合化学 有机化学 物理 量子力学
作者
Yuan Zhang,Chen Yang,Sijia Peng,Jing Ling,Peng Chen,Yumiao Ma,Wenjuan Wang,Zhixing Chen,Chunlai Chen
出处
期刊:Journal of the American Chemical Society [American Chemical Society]
卷期号:145 (7): 4187-4198 被引量:18
标识
DOI:10.1021/jacs.2c12635
摘要

Maleimide-cysteine chemistry has been a routine practice for the site-specific labeling of fluorophores to proteins since the 1950s. This approach, however, cannot bring out the best photon budget of fluorophores. Here, we systematically measured the Cyanine3/5 dye conjugates via maleimide-thiol and amide linkages by counting the total emitted photons at the single-molecule level. While brightness and signal-to-noise ratios do not change significantly, dyes with thioether linkages exhibit more severe photobleaching than amide linkers. We then screened modern arylation-type bioconjugation strategies to alleviate this damage. Labeling thiols with phenyloxadiazole (POD) methyl sulfone, p-chloronitrobenzene, and fluorobenzene probes gave rise to electron-deficient aryl thioethers, effectively increasing the total emitted photons by 1.5-3 fold. Among the linkers, POD maintains labeling efficiency and specificity that are comparable to maleimide. Such an increase has proved to be universal among bulk and single-molecule assays, with or without triplet-state quenchers and oxygen scavengers, and on conformationally unrestricted or restricted cyanines. We demonstrated that cyanine-POD conjugates are general and superior fluorophores for thiol labeling in single-molecule FRET measurements of biomolecular conformational dynamics and in two-color STED nanoscopy using site-selectively labeled nanobodies. This work sheds light on the photobleaching mechanism of cyanines under single-molecule imaging while highlighting the interplay between the protein microenvironment, bioconjugation chemistry, and fluorophore photochemistry.
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