Construction of Synthetic Nanobody Library in Mammalian Cells by dsDNA‐Based Strategies**

转染 生物 肽库 表情盒 电穿孔 同源重组 HEK 293细胞 细胞生物学 计算生物学 细胞培养 重组DNA 化学 分子生物学 DNA 遗传学 基因 肽序列 载体(分子生物学)
作者
Yanjie Zhao,Yi Wang,Weijun Su,Shuai Li
出处
期刊:ChemBioChem [Wiley]
卷期号:22 (20): 2957-2965 被引量:10
标识
DOI:10.1002/cbic.202100286
摘要

Abstract A nanobody is an antibody fragment consisting of a single monomeric variable antigen‐binding domain. Mammalian cells are ideal platforms for identifying nanobodies targeting hard‐to‐display transmembrane proteins and nanobodies that function as modulators of cellular phenotypes. However, the introduction of a high‐diversity nanobody library into mammalian cells is challenging. We have developed two novel methods for constructing a nanobody library in mammalian cells. Complementarity‐determining region (CDR) random sequences were first incorporated into upstream and downstream dsDNAs by PCR. In the first method, named dsDNA‐HR, upstream and downstream dsDNAs containing an identical overlapping sequence were co‐transfected into cultured mammalian cells for intracellular homologous recombination that resulted in the formation of an intact nanobody library expression cassette. In the second method, named in vitro ligation, we generated full‐length nanobody expression dsDNAs via ligation of restriction digested upstream and downstream dsDNAs. The obtained full‐length dsDNAs were transfected into mammalian cells for nanobody library expression. Using both methods, we generated over a million unique nanobody sequences, as revealed by high‐throughput sequencing. Single‐cell sequencing was employed to resolve the diversity of the dsDNA‐HR nanobody library. We also identified a small molecule, Nocodazole, which could enhance the efficacy of dsDNA‐HR.
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