On the low reproducibility of cancer studies

早前有研究指出，近九成肿瘤生物学论文的实验结果不能重复。最近，eLife期刊上刊登了五个详细的重复性研究，将这一数字证实。研究结果的不可重复常被归咎于人为因素，因而认为可以避免。但是其原因也可能是生物学上的，以致这些研究本质上就无法重复。肿瘤研究的可重复率低，将深刻地影响到临床的方案，同时也反映出肿瘤生成多样的进化通路。 背 景 可重复性是实验科学的基础。尽管多种因素困扰着不同研究领域，影响的程度也不尽相同，肿瘤研究却显得首当其冲。早前一个报告指出，53个发表的肿瘤研究，只有6个的结论可被重复。可重复率低至10%，让人担忧。该报告同时还指出，极低的可重复率也是制药工业界的普遍经验。 这么低的重复率引起了特别关注。因为那些成果一般都发在高影响因子杂志上，所以它们对肿瘤的临床与基础研究正有着实质的影响。通过这篇评论，我们首先回顾对研究结果可重复性的最新评估。第二，我们将探讨造成这低重复率的根本原因。尽管低重复率常被归咎于人为因素，但实际上是有更深层生物学原因的。第三，哪些研究应该能重复，哪些研究本质上就不可重复，我们应做一个明确的划分。第四，我们为如何应对结果不可重复提出了一些建议。 可重复性评估的最新消息：肿瘤重复性研究项目 肿瘤重复性研究项目（RP：CB）是为了严格地解决可重复性这个问题而发起的。它选了高影响因子期刊上 30个肿瘤研究进行可重复性研究。因为不能重复大都是由于技术因素，该项目的重要贡献之一就是排除了这些明显原因的可能性。正式重复研究之前的注册报告会概述重复实验的设计。实验设计被审议并通过后，重复性研究才开始进行。因为双方都同意可重复性原则，所以重点放在确保实验材料与方法被准确复制。 第一批研究报告已经发表。可重复性在报告里指“治疗方案的可操作性与可重复性”，因为这些原论文都包含了一个治疗方案。按eLife编辑部的说法，其中两个研究“可重复重要部分”，一个“不可以重复”，余下两个“难以判读”。另一个新闻报告把整体结果描述成“混乱如泥”。我们认为这些判读过于谨慎了，从更为常规的角度看，五个研究中有四个都该被判为“不可重复”，一个“难以判读”（如下表所示）。 我们就从eLife编辑部认为难以判读的两个报告说起。两个实验被定为难以判读是因为其对照组的不可重复。对照组不能被重复与实验本身不能被重复其实并无大异，我们因此把这两个研究判定为“不可重复”。在Berger等人的论文中，PREX2基因在人黑色素瘤中普遍发生了突变（107个中有15个）。进一步地，引入了PREX2突变的人黑色素细胞进行的异体成瘤实验发现，实验小鼠的无瘤生存期显著缩短。Horrigan等人在重复性研究中，引用了近期的研究。这些研究并不支持人黑色素瘤中普遍发生了PREX2基因突变这个说法。并且，Horrigan等人不能证实PREX2突变能降低无瘤生存率，因为没有突变的对照组的死亡速度也是一样快（1周）。这与原论文中公布的9周中位生存期结果相反。 在另一个研究中，Willingham等人指出，CD47蛋白在多数癌症细胞膜是过表达的。由于CD47信号通路会阻止巨噬细胞对癌细胞的攻击，因此阻断CD47通路，可使经注射了MT1A2癌细胞的免疫活性小鼠中原位乳腺肿瘤的大小比对照组减少约10倍。而在Horrigan等人的重复研究中，肿瘤的大小离奇地在CD47处理组与IgG处理的对照组中逆转过来了。Horrigan指出，肿瘤的大小是高度可变的。通常，在同一种处理条件下可有5倍的差异变化。在肿瘤进化中，这种高度的可变性也很普遍，但常常被视为噪音了。应该指出的是，Willingham等人通过将人肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠中也获得了类似的结果。Horrigan报告说，异种移植实验仅在一些后续研究中得到了重复。 报告中被判为一定不可重复的，是Sugahara等人的研究。他们发现用iRGD多肽处理肿瘤可使肿瘤细胞对药物的通透性增加。在他们的研究中，肿瘤是由异体移植的前列腺癌细胞所生成。Mantis等人不能重复出该结果，但过去别的研究报告认为这结果是可重复的。所以 Sugahara等人的工作虽然 eLife无法重复，但这工作并没有特别不可靠之处。 对于其余两项宣称“本质上可重复”的研究，有一项在大多数情况下是不会被认为是可重复的。Sirota等人的在细胞系上进行药物研发的生物信息学分析发现，西咪替丁可作为抗肺腺癌细胞的有效分子。虽然相同的趋势在Kandela等人的重复研究也能看到，但与对照组的差异并不显著。如Dang所说，其原因是Sirota等人报道的西咪替丁的作用太弱，而不具有生物学意义上的显著性。总体而言，与平均值的小差异相比，以这样的组内差异很难得出西咪替丁可成为治疗肺癌的有效新药。 5项研究中唯一可重复的是Delmore等人的研究。 在原研究中，他们报道小分子（+）- JQ1通过下调MYC的转录并减少多发性骨髓瘤的大小，从而改善异种移植小鼠的存活情况。 虽然Aird等人成功重复出了该结果（有一些变化），但使用不影响MYC转录的对映异构体（-）- JQ1的阴性对照组得到了与（+） - JQ1相同的生物学效应。鉴于阴性对照也会产生相同的效应，我们建议将原研究定为难以判读。 不能重复的原因 五次重复实验证实了先前报告中6/53的重复率。以前的报道暗示了是技术（甚至伦理）失误是导致低重复率的原因；然而，它们所提及的因素在整个生物学科中都很常见。而且，人们对RP：CB的悉心投入，也说明在重复性研究的努力应是充分的。因此，下面我们来寻求生物学的解释。 实验研究能否重复，取决于复制实验的测量结果能否符合原实验。 投掷硬币时，连续五次看到同一面的重复率不会高于10％。 在癌症生物学中，重复性意味着肿瘤发展过程对应于高度受限的过程，类似于组织的发育。但是，如果肿瘤发展循着进化的路径，那么结果就可能变化很大。进化过程往往包含多个步骤，需要一系列的遗传变化。而这些变化又都由随机因素控制，包括突变的出现，随机漂变和不同选择压力。由于每一步又都受前一步的影响，因此早期的小偏差也可能产生迥异的结果。 S. J. Gould在他的《奇妙的生命》一书中提出了进化本身的再现性问题。他好奇如果我们回卷“生命的磁带”，进化是否会遵循相同的轨迹重新展开（另见康威•莫里斯）。“将生命磁带卷回”到寒武纪大爆发当然只是幻想，但不断重复的进化过程确实存在，最好的例子可能就是癌症的进化了。因此RP: CB的注册/复制报告，以及编辑意见和评论中都没出现“进化”一词，实在让人摸不着头脑。 可重复的进化过程等同于趋同进化。在趋同进化中，生物重复地“选择”了一条有主导优势的进化路径。在趋同进化的范畴中，表型与基因型的区别尤为重要。自然界中，表型趋同是常见的。表型的趋同也是病理学家定义肿瘤恶性的基础。然而关键问题是：构成表型基础的基因型是否也有那样的趋同性呢？肿瘤生物发表论文中对体细胞突变、基因表达、靶向治疗不断引证，显然是认为基因型也有趋同性。 在这种背景下，大型研究项目TCGA（美国癌症基因体图谱计划）曾试图寻找肿瘤中经常突变的基因。结果是，肿瘤细胞的基因型趋同性比所希望的要低得多。比如说，12种癌症中，只有两个基因（TP53和PIK3CA）在超 10%的案例中发生突变。TP53是人基因组上的一个特殊分子，而PIK3CA 基因很长。对一特定癌症而言，肿瘤共有的高突变（在多于10%的情形中突变）的基因数一般只有10个左右。在如此低的基因趋同性下，二个同样类型的癌症往往只有少数的突变基因相同，甚至是一个没有。这些观察说明，即使开始条件相近，肿瘤也会循着不同进化轨迹发展。即使是从同一个起点（来自同一个人）开始的癌细胞，也会进入不同进化轨迹，产生丰富的基因多样性，因而对同一治疗产生不同响应。 TCGA项目反映出来的现象在自然群体中是同样存在的。尽管可观察到像回声定位基因这样的特别的基因趋同现象，但这很少见。对于并不涉及到有高度特化结构的生物，生物分子的多样性机制依然起效，于是基因型趋同将不会发生。例如，对高纬度的西藏，埃塞俄比亚，安第斯高原的居民来说，他们在高原环境的低氧适应性方面的基因突变是不同的。最近，为了寻找这一现象的分子趋同机制的大型基因组测序分析发现，这些相关的突变遍布了人的整个基因组。这再一次说明，即使在相同的环境下的多个基因组，分子趋同性还是不常见的，而其涉及的信号甚至很少超过实验结果的背景噪音。 尽管如此，癌症发展和生物体趋同进化是可以观察到的，只是条件非常严格：必须得有一个决定性的进化途径来介导最后结果的产生。比如，当实验生物体的基因非常简单（比如病毒），那么基因进化的可选择方式就只有少数几种。或者，当对特定遗传变化的选择压力很强时，则可能会出现分子趋同的结果。为此，Wu等人推测，“液体肿瘤”里，选择压力就可能特别高，因为具有增殖优势的细胞在里面可以迅速而广泛地扩散。确实，慢性粒细胞白血病，以其特征性BCR-ABL异位融合作为一个诊断标准，就是肿瘤在基因水平上进化趋同的一个最好例子。总的来说，当充分考虑了肿瘤进化的表型多样性与基因多样性的本质，以及哺乳动物基因组的复杂性的时候，我们可以推断出肿瘤发展过程的分子趋同性是个例，而非普适原则。 诚如TCGA所揭示的，真实情况下肿瘤发生分子趋同的可能性很低。但人们依旧期望，当大部分的实验条件受到控制时，他们能在小鼠身上发现高程度的趋同现象。如今，即使在简单的模型里，RP:CB项目也证实了进化的不可预测性。在5个RP:CB报告中，来自癌细胞系的细胞被移植到小鼠身上，或是自体或是异体移植。接着，实验组（E）与对照组（C）的样品被收集，作为原论文的E1,C1与重复研究的E2,C2。每只小鼠的肿瘤的生长是两个进化过程累积的结果。第一个是在移植前，待移植的癌细胞群体已经发生了差异性的进化。第二个是在移植后，癌细胞继续发生异质性的改变。移植后的变化经常在分析中被提到的，但移植前的变化却往往被忽略，即使进化不断。肿瘤细胞这一阶段的变化让人联想起经典的“卢里亚/德尔布吕克波动”。 由E1，C1，与E2，C2两次研究所得到的结果都是条件分布的。RP:CB的最终分析依据对（E1,C1）和（E2,C2）的比较。在那些不能重复出原结果的研究中，C1和C2在二项研究（PRX2, CD47）的实验里没有经历相同的进化过程， E1和E2在一项研究（iRGD）中趋异进化（参考表1）。在另一项研究（cimetidine）中，E1和C1的差别太小而没有生物学或统计学意义上的显著性。 RP:CB报告的肿瘤进化过程可用下图这样一个简单遗传模型勾画出来，它将进化途径定义为服从条件概率。这里，通过从已有的多样性里独立出来或是出现新的基因突变，进化每一步都受着前一步的影响。因此前一步的微小变化都可能会带来之后的更大差异。在图1的阶段2中，两个重复实验的轨迹几乎没有重叠，因此出现了非常不同的肿瘤表型。如果采用比图1更真实的模型来分析，所得到的肿瘤将很可能属于不同模式。我们因此建议，肿瘤研究需要发展出明确的肿瘤进化模型，而不能假定结果是简单和可重复的。 哪些研究能重复，哪些不能？ RP:CP项目在一定程度上揭示出了什么研究是可能重复的，什么是不可能重复的。如果所分析的表型在实验过程中不发生进化，那么重现性通常很高。例如化合物JQ1处理后使得MYC转录下调的结果是可以重复出来的。同样的，Horrigan所进行的重复实验也观察到使正常小鼠出现轻度贫血的毒性作用：该实验中，小鼠的组织是未发生进化的。 在肿瘤的进化中，可重复性将是一个关于进化途径的数量，强度和长度的函数。TCGA的数据表明，肿瘤进化所涉及的路径数目一定相当大。而随着每一路径上的步骤数目增多，不同可能性的量就将呈指数增长。这就使得许多肿瘤研究结果不能被重复。我们还应注意到，图1中对随附性（contingent）进化的描画，将因样本数量的增加而变得非常困难。 面对进化路径的多样性，肿瘤生物学研究往往试图分离出共有部分路径的病例：比如共有EGFR基因突变的肺癌。这些病例确实对EGFR抑制剂显示出稳健及比较可重复的结果。但这些被部分划定的遗传途径仍然常常是多样的，也常常产生不可重复的结果，如肿瘤耐药性。 结 论 让人奇怪的是，几乎没人对RP:CB和之前的其他重复性研究做出讨论。也许根据主流观点，既然低重复率是人为因素造成的，那就无须进一步的深入探讨了。但这个缺乏证据的说法，可能掩盖了低重复率背后更根本的原因。从进化的角度来看，很多研究固有地无法重复，是因癌变通常不沿着同一进化路径发展。 目前，可重复性仍然是肿瘤生物学研究的核心原则。该原则假设了肿瘤的趋同进化，并认为肿瘤在其中会经历相对明确的遗传变化。于是，在基础研究中，我们发现了遗传上的一些改变，然后就研发靶向这些改变的治疗策略（即靶向治疗）。然而，基础遗传结构的持续演变使得突变成为了“移动的目标”，无论是在个体之间还是个体内部。从这个角度上讲，基因靶向治疗违背了进化的原则。 不进化或缓慢演化的性状可能是更好的目标。耐药性的演变确实也仍是癌症靶向治疗的主要障碍。主要的3种单克隆抗体药物贝伐单抗，曲妥珠单抗和利妥昔单抗的疗效具有指导意义。贝伐单抗和曲妥珠单抗分别靶向VEGF和HER-2，然而疗效有限。相反，利妥昔单抗是靶向在pre-B细胞表面都表达的CD20，能显著提高B细胞淋巴瘤患者的生存期。这也许是因为它不以细胞进化的产物作为靶点。近期的靶向基础转录装置的治疗策略，与这种支持以非变动分子作为靶标的看法是相一致的。 最后，尽管许多疾病从达尔文式医学的角度来看，都是进化的产物或副产物，但肿瘤的发生是不同的，因为它并不仅仅是进化的产物：它就是进化过程本身，或者说是进化正在进行的表现。Lewontin指出，进化的精髓就是其多样性。值得探讨的正是这种多样性，而非某个标准型。对于肿瘤研究，进化路径的多样性也有显著的临床意义。H. J. Muller在《物种起源》出版一百周年时，评论说生物学已经很长时间没有进化思维了。如今五十年又过去了，Muller的评论对肿瘤研究依旧不显过时。