Assembly pathway of the fungal COP9 signalosome

Das COP9 Signalosom (CSN Komplex) ist ein Proteinkomplex aus acht Untereinheiten, der in höheren Eukaryoten konserviert ist und für die multizelluläre Entwicklung benötigt wird. CSN kontrolliert den Austausch von Substrat-Rezeptoren von E3 Ubiquitin-Cullin-RING Ligasen und damit die Spezifität des Protein-Abbaus in eukaryotischen Zellen. Beim Aufbau des CSN Holokomplexes des filamentösen Pilzes Aspergillus nidulans wird im letzten Schritt die katalytische CsnE Deneddylase-Untereinheit in einen sieben-Untereinheiten Prä-CSN Komplex eingebaut. Hauptziel der Doktorarbeit war die in vivo Identifikation der zellulären Schritte, die für den Zusammenbau des Gesamtkomplexes aus den einzelnen CSN- Untereinheiten notwendig sind. Dafür wurden genetischen und biochemischen Methoden kombiniert. Alle CSN Untereinheiten werden für die sexuelle Entwicklung und den dazu gehörenden Sekundärmetabolismus benötigt. Daneben können einzelne Untereinheiten des Prä-CSN Komplexes das Wachstum der Kolonie und die asexuelle Entwicklung unterstützen. Entsprechende funktionelle GFP-CSN Fusionsproteine, die alle diese Phänotypen komplementieren können, wurden für GFP-Affinitätsanreicherungen und anschließende Massen-Spektrometrie in unterschiedlichen csn-Mutanten verwendet. Ein Hauptergebnis dieser Interaktom-Analyse war die Entdeckung von zwei heterotrimer Subkomplexen als Zwischenstufe für den Aufbau des CSN Komplexes. Diese beiden Trimere, CsnA-CsnC-CsnH und CsnD-CsnF-CsnG, werden unabhängig von CsnB gebildet. CsnE ist nicht in der Lage mit einem der beiden Trimere zu interagieren, wenn CsnB in der Zelle fehlt. CsnB ist daher notwendig, um die beiden Trimere zum Prä-CSN Komplex zu verbinden und damit die Inkorporation von CsnE als finalem Schritt der Komplexbildung zu ermöglichen. Die zellulären Proteinmengen für die einzelnen CSN Untereinheiten werden durch unterschiedliche Feedback-Mechanismen kontrolliert. Die Wild-Typ-Menge an CsnA Protein wird nur dann in der Zelle erreicht, wenn ausreichend Proteine für die anderen Untereinheiten der beiden Trimere vorhanden sind. CsnA wird andererseits benötigt, um ausreichende Mengen des Brücken-Proteins CsnB zu bekommen. Die Menge an CsnD, das ein Teil des CsnD-CsnF- CsnG Trimers darstellt, wird umgekehrt erhöht, wenn ausreichende Mengen anderer Untereinheiten des Prä-CSN Komplexes fehlen. Diese Ergebnisse weisen auf ein komplexes zelluläres Überwachungssystem, das die Proteinmengen für die beiden Trimere, für das Brückenprotein CsnB und die Deneddylase CsnE, und damit den akkuraten Aufbau des gesamten CSN Komplexes kontrolliert. Ein weiteres Kontrollsystem steuert die zelluläre Lokalisierung der CSN Untereinheiten. Der stabile acht-Untereinheiten CSN Holokomplex ist überwiegend im Zellkern lokalisiert. Der CsnD-CsnF-CsnG Subkomplex befindet sich auch vorwiegend im Nukleus, während das CsnA-CsnC-CsnH Trimer zwischen Zytoplasma und Zellkern verteilt ist. Die Anreicherung des Brückenproteins CsnB im Zellkern erfordert CsnA, aber nicht die CsnE Deneddylase. Vermutlich wird CsnB daher mit CsnA oder mit dem CsnA- CsnC-CsnH Trimer in den Kern transportiert. Insgesamt ergab die hier durchgeführte Analyse, dass der zelluläre Aufbau des COP9 Signalosoms bei A. nidulans über die Bildung zweier Trimere führt, die durch CsnB verknüpft werden. Dies ermöglicht dann die Inkorporation der CsnE Deneddylase als einziger Untereinheit des CSN Holokomplexes mit intrinsischer Enzymaktivität. Der Aufbauprozess erfordert ein vielfältiges Zusammenspiel zwischen wechselseitiger Kontrolle der Proteinmengen der Untereinheiten, deren korrekter zellulärer Lokalisierung und ihres sequentiellen Zusammenbaus.