Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening

清脆的 Cas9 生物 计算生物学 引导RNA 遗传学 基因组编辑 遗传筛选 索引 基因组 核糖核酸 基因 表型 单核苷酸多态性 基因型
作者
Julia Joung,Silvana Konermann,Jonathan S. Gootenberg,Omar O. Abudayyeh,Randall J. Platt,Mark D. Brigham,Neville E. Sanjana,Feng Zhang
出处
期刊:Nature Protocols [Springer Nature]
卷期号:12 (4): 828-863 被引量:1000
标识
DOI:10.1038/nprot.2017.016
摘要

Forward genetic screens are powerful tools for the unbiased discovery and functional characterization of specific genetic elements associated with a phenotype of interest. Recently, the RNA-guided endonuclease Cas9 from the microbial CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) immune system has been adapted for genome-scale screening by combining Cas9 with pooled guide RNA libraries. Here we describe a protocol for genome-scale knockout and transcriptional activation screening using the CRISPR-Cas9 system. Custom- or ready-made guide RNA libraries are constructed and packaged into lentiviral vectors for delivery into cells for screening. As each screen is unique, we provide guidelines for determining screening parameters and maintaining sufficient coverage. To validate candidate genes identified by the screen, we further describe strategies for confirming the screening phenotype, as well as genetic perturbation, through analysis of indel rate and transcriptional activation. Beginning with library design, a genome-scale screen can be completed in 9-15 weeks, followed by 4-5 weeks of validation.
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