Nucleic acid hybridization assays employing dA-tailed capture probes

核酸 核酸热力学 核酸检测 计算生物学 杂交探针 化学 生物 分子生物学 生物化学 DNA 基序列
作者
Dylan Morrissey,Massimo Lombardo,John Eldredge,Kevin R. Kearney,E. Patrick Groody,Mark L. Collins
出处
期刊:Analytical Biochemistry [Elsevier BV]
卷期号:181 (2): 345-359 被引量:65
标识
DOI:10.1016/0003-2697(89)90255-8
摘要

A quantitative hybridization assay termed "reversible target capture" is described. The technique is designed to extensively purify the target nucleic acid from crude cell lysates in about 1 h without phenol extraction. Simple, rapid methods are described that explain how each process in the assay is optimized. The procedure involves hybridizing the target nucleic acid in solution with a dA-tailed capture probe and a labeled probe. The capture probe-target-labeled probe "ternary complex" is then captured on magnetic beads containing oligo(dT). After the excess unhybridized labeled probe, cell debris, and other sample impurities are washed away, the intact ternary complex is further purified by chemical elution from the beads and recapture on fresh beads. The ternary complex is then eluted thermally and recaptured on a third set of beads or on poly(dT) filters. This triple capture method results in a detection limit of approximately 0.2 amol (100 fg) of target with 32P-labeled riboprobes. This is approximately 1000 times more sensitive than sandwich assays employing only a single capture step. The method is illustrated by detecting Listeria cells in the presence of heterologous bacteria. With three rounds of target capture, as few as six Listeria cells have been detected in the presence of 1.25 x 10(7) control cells.
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