CRISPR-Mediated rDNA Integration and Fluorescence Screening for Pathway Optimization in Pichia pastoris

清脆的 毕赤酵母 香叶醇 计算生物学 发起人 蛋白质工程 生物化学 定向进化 基因组工程 巴纳斯 遗传学 生物 化学 基因组编辑 基因表达 基因 核糖核酸 重组DNA 突变体 精油 核糖核酸酶 食品科学
作者
Xiaojing Jiang,Mengxin Li,Zhijiao Wang,Cuifang Ye,Jucan Gao,Xiaowei Ai,Jingfei Bao,Jintao Cheng,Jiazhang Lian
标识
DOI:10.1021/cbe.4c00104
摘要

Gene dosage amplification is an effective strategy to improve the performance of heterologous genes and pathways. Pichia pastoris is an excellent recombinant protein expression host with high efficiency in protein folding and glycosylation. However, the traditional iterative multicopy integration method typically faces challenges such as being time-consuming and having high cost and potential gene mutations. Accordingly, we established CRISPR-mediated rDNA integration and fluorescence screening for pathway optimization (CRISPO) for multicopy pathway integration in a single-step and antibiotic-free manner. With geraniol biosynthesis as a case study, we designed CRISPO based on the use of glycerol-induced and glucose-repressed promoters (CRISPOi) or strong constitutive promoters (CRISPOc) to drive the expression of the red fluorescent protein mCherry as the screening marker. We employed CRISPOi for stable strain construction by multicopy integration of the geraniol synthase encoding gene, achieving a 19.5-fold increase in geraniol production. We demonstrated CRISPOc for visualizing and determining the rate-limiting steps of the mevalonate pathway, with HMG1 and ERG12 identified as the major rate-limiting enzymes through two rounds of exploration. Ultimately, CRISPO enabled us to construct an engineered P. pastoris strain producing 1.66 g/L geraniol (with a total of 2.12 g/L monoterpenoids) and 6.27 g/L geraniol (with a total of 6.48 g/L monoterpenoids) in 24-well plates and 5 L fermenters, respectively, representing the highest titer and productivity of geraniol ever reported. CRISPO is an important addition to the synthetic biology toolbox for the construction and optimization of P. pastoris cell factories.
最长约 10秒,即可获得该文献文件

科研通智能强力驱动
Strongly Powered by AbleSci AI
更新
PDF的下载单位、IP信息已删除 (2025-6-4)

科研通是完全免费的文献互助平台,具备全网最快的应助速度,最高的求助完成率。 对每一个文献求助,科研通都将尽心尽力,给求助人一个满意的交代。
实时播报
1秒前
鲤鱼一手发布了新的文献求助10
1秒前
lingjing完成签到,获得积分10
1秒前
华仔应助Tetrahydron采纳,获得30
2秒前
量子星尘发布了新的文献求助10
2秒前
慈祥的冬瓜完成签到,获得积分10
2秒前
2秒前
Mira完成签到,获得积分10
3秒前
温柔手机完成签到,获得积分10
3秒前
3秒前
Lindsay完成签到,获得积分10
4秒前
巧克力完成签到 ,获得积分10
4秒前
4秒前
4秒前
5秒前
5秒前
fengyuenanche完成签到,获得积分10
5秒前
5秒前
6秒前
7秒前
一瓶水发布了新的文献求助10
7秒前
橙子发布了新的文献求助10
7秒前
乐乐发布了新的文献求助20
8秒前
未来发布了新的文献求助10
8秒前
lalafish发布了新的文献求助10
9秒前
oyxz完成签到,获得积分10
9秒前
柔弱小之发布了新的文献求助10
9秒前
10秒前
Chemistry完成签到,获得积分10
10秒前
10秒前
niu发布了新的文献求助10
11秒前
简单的钢铁侠完成签到,获得积分10
11秒前
赘婿应助Demonmaster采纳,获得10
11秒前
张通发布了新的文献求助10
12秒前
拜拜拜仁完成签到,获得积分10
12秒前
12秒前
13秒前
13秒前
14秒前
14秒前
高分求助中
A new approach to the extrapolation of accelerated life test data 1000
‘Unruly’ Children: Historical Fieldnotes and Learning Morality in a Taiwan Village (New Departures in Anthropology) 400
Indomethacinのヒトにおける経皮吸収 400
Phylogenetic study of the order Polydesmida (Myriapoda: Diplopoda) 370
基于可调谐半导体激光吸收光谱技术泄漏气体检测系统的研究 350
Robot-supported joining of reinforcement textiles with one-sided sewing heads 320
Aktuelle Entwicklungen in der linguistischen Forschung 300
热门求助领域 (近24小时)
化学 材料科学 医学 生物 工程类 有机化学 生物化学 物理 内科学 纳米技术 计算机科学 化学工程 复合材料 遗传学 基因 物理化学 催化作用 冶金 细胞生物学 免疫学
热门帖子
关注 科研通微信公众号,转发送积分 3986829
求助须知:如何正确求助?哪些是违规求助? 3529292
关于积分的说明 11244137
捐赠科研通 3267685
什么是DOI,文献DOI怎么找? 1803843
邀请新用户注册赠送积分活动 881223
科研通“疑难数据库(出版商)”最低求助积分说明 808600