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Quantitative real-time PCR detection of oral Enterococcus faecalis in humans

粪肠球菌 16S核糖体RNA 微生物学 细菌 实时聚合酶链反应 核糖体RNA 生物 根管 化学 分子生物学 医学 基因 牙科 生物化学 金黄色葡萄球菌 遗传学
作者
Christine Sedgley,Aaron C. Nagel,Charles E. Shelburne,Don B. Clewell,Oliver K. Appelbe,Anders Molander
出处
期刊:Archives of Oral Biology [Elsevier]
卷期号:50 (6): 575-583 被引量:117
标识
DOI:10.1016/j.archoralbio.2004.10.017
摘要

Enterococcus faecalis is consistently associated with recurrent root canal infections. Only low concentrations of E. faecalis in the human mouth have been demonstrated by culture techniques. Quantitative detection strategies more sensitive than culturing, such as quantitative PCR (qPCR), could provide more illuminating data. Thirty outpatients attending the University of Michigan Graduate Endodontic Clinic for endodontic treatment provided oral rinse samples that were analysed for E. faecalis using qPCR and microbiological culturing. A SYBR Green I qPCR protocol was developed for the quantifiable detection of E. faecalis and total bacteria in oral rinse samples using primers designed to target the 16S rRNA gene. Annealing temperature and primer, magnesium ion, and dimethyl sulfoxide concentrations were investigated for optimisation of the protocol; a minimum sensitivity limit of 23 rRNA copies (an estimated six E. faecalis cells) was established for E. faecalis in pure culture, and 104 rRNA copies (an estimated 26 E. faecalis cells) in mixed culture. In qPCR assays, based on extrapolation from estimated rRNA gene copy numbers, E. faecalis comprised 0.0006–0.0047% of a total bacteria load that ranged from 5.92 × 105 to 5.69 × 107 cells/ml of oral rinse. E. faecalis was detected in five (17%) samples in concentrations from 114 to 490 cells/ml. In parallel culture assays E. faecalis were detected in only two samples (7%) of the five identified by qPCR and in concentrations 30 and 240 CFU/ml. qPCR reported a higher incidence of E. faecalis in oral rinse samples than culture techniques and afforded greater sensitivity.
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