Enzymatic Desialylation Enables Reliable Charge Variant Characterization of Highly Glycosylated and Sialylated Fc Fusion Proteins

表征(材料科学) 化学 融合 生物化学 融合蛋白 计算生物学 生物 重组DNA 材料科学 纳米技术 基因 语言学 哲学
作者
Xiaona Wen,Anita P. Liu,Jing Song,Chuan Leng,Jingzhou Wang,Beatrice Russo,Geetha Thiagarajan,Hongxia Wang,Ximeng Y. Dow,Xiaoqing Hua,Xiaoping Ao,Sarita Mittal,Lynn Gennaro,Rico C. Gunawan
出处
期刊:ACS pharmacology & translational science [American Chemical Society]
卷期号:8 (2): 394-408
标识
DOI:10.1021/acsptsci.4c00460
摘要

Fusion proteins constitute a class of engineered therapeutics and have emerged as promising candidates for disease treatment. However, the structural complexity and heterogeneity of fusion proteins make their characterization extremely challenging, and thus, an innovative and comprehensive analytical toolbox is needed. Here, for the first time, we demonstrate a novel and robust workflow to evaluate charge variants for a highly glycosylated fusion protein with heavy sialylation using imaged capillary isoelectric focusing (icIEF). In the development of the icIEF method, key factors that were systematically investigated include the desialylation level, the stability of the desialylated molecule, incubation time and temperature of desialylation, protein concentrations, urea and l-arginine effects on the tertiary structure, and instrumental comparability. Multivariate and correlation analyses were subsequently applied to confirm the impacts of the parameters evaluated. Furthermore, a microfluidic chip-based icIEF system coupled with ultraviolet detection and mass spectrometry (icIEF-UV/MS) was utilized to identify critical post-translational modifications and ameliorate the understanding of charge variants. Our study demonstrates that this workflow enables a mechanistic understanding of charge variants for heavily sialylated therapeutics.
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