Establishment of a baculovirus-mediated CRISPR-Cas9 based knock-down system in Sf9 insect cells

Diese Arbeit wurde durchgefuhrt, um ein Baculovirus-vermitteltes, auf CRISPR-Cas9basierendes knock-down System in Sf9 Insektenzellen zu etablieren. Als Kontrolle des erfolgreichen Knock-downs verwendeten wir das fluoreszierende Protein mCherry als knock-out Ziel. Sf9 Zellen wurden mit zwei unterschiedlichen Bakuloviren infiziert. Ein Virus enthalt die Expressionskassette fur die Cas9 Nuklease und die Transkriptionskassette fur eine mCherry-spezifische sgRNA, das andere Virus kodiert das Zielprotein, sowie ein YFP Infektionsreporterprotein. Die Signalintensitat der Fluoreszenzproteine mCherry gegen YFP wurde gemessen, weiters wurde die knock-down Effizienz berechnet. In unseren Experimenten testeten wir unterschiedliche Cas9 in vivo Konzentrationen, wobei die Cas9 Nuklease mittels Verwendung eines jeweils schwachen oder starken AcMNPV Promotors exprimiert wurde. Weiters ermittelten wir die knock-out Effizienz von einer oder zwei verschiedenen mCherry-spezifischen sgRNAs. Die Ergebnisse zeigen, dass das Vorhandensein von zwei verschiedenen sgRNAs zu einem gesteigerten Knock-down fuhren. Zusatzlich wurde gezeigt, dass hohere Cas9 in vivo Konzentrationen die Effizienz, das Zielgen auszuschalten, erhohen. Es sind weitere Experimente notig, um die Interaktion zwischen der sgRNA und mCherry zu untersuchen, da auch das Vorhandensein von sgRNA allein einen Knock-down Effekt erzielt. Basierend auf den derzeitigen Ergebnissen ist die Anwendung zusatzlicher Methoden fur den Nachweis von Mutationen innerhalb des Zielgens, die durch das CRISPR-Cas9 System verursacht werden, erforderlich, um die erfolgreiche Etablierung eines Bakulovirus-vermittelten CRISPR-Cas9 basierenden knock-down Systems in Sf9 Zellen zu bestatigen.