Cytoplasmic calcium measurement in rotavirus enterotoxin-enhanced green fluorescent protein (NSP4-EGFP) expressing cells loaded with Fura-2

绿色荧光蛋白 细胞内 生物学中的钙 融合蛋白 细胞质 HEK 293细胞 细胞生物学 生物 转染 化学 生物物理学 分子生物学 生物化学 重组DNA 基因 有机化学
作者
Zuzana Berkova,Andrew P. Morris,Mary K. Estes
出处
期刊:Cell Calcium [Elsevier BV]
卷期号:34 (1): 55-68 被引量:41
标识
DOI:10.1016/s0143-4160(03)00022-8
摘要

The green fluorescent protein (GFP) and its analogs are standard markers of protein expression and intracellular localization of proteins. The fluorescent properties of GFP complicate accurate measurement of intracellular calcium using calcium sensitive fluorophores, which show a great degree of spectral overlap with GFP, or their Kd values are too high for accurate measurement of subtle changes in cytoplasmic calcium concentrations. Here we describe a simple modification of the standard microscope-based Fura-2 calcium-imaging technique which permits the quantitative measurement of intracellular calcium levels in cells expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP) fusion proteins. Longpass emission filtering of the Fura-2 signal in cells expressing an EGFP fusion protein is sufficient to eliminate the EGFP–Fura-2 emission spectra overlap and allows quantitative calibration of intracellular calcium. To validate this technique, we investigated the ability of rotavirus enterotoxin NSP4-EGFP to elevate intracellular calcium levels in mammalian HEK 293 cells. We show here that inducible intracellular expression of NSP4-EGFP fusion protein elevates basal intracellular calcium more than two-fold by a phospholipase C (PLC) independent mechanism.
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