Quantification of RuBisCO Expression and Photosynthetic Oxygen Evolution in Cyanobacteria

Phototrophic microorganisms are frequently engineered to regulate the expression and the activity of targeted enzymes of interest for specific biotechnological and agricultural applications. This protocol describes a method to evaluate the expression of RuBisCO (ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase) in the model cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942, at both the transcript and protein levels by quantitative PCR and Western blot, respectively. We further describe an experimental method to determine photosynthetic activity using an oxygen electrode that measures the rate of molecular oxygen production by cyanobacterial cultures. Our protocol can be utilized to assess the effects of RuBisCO engineering at the metabolic and physiological levels., [摘要] 光养微生物经常被设计用于调节特定生物技术和农业应用中感兴趣的目标酶的表达和活性。该协议描述了一种评估 RuBisCO（核酮糖 1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶）在模型蓝藻细长聚球藻PCC 7942 中的表达的方法，分别通过定量 PCR 和蛋白质印迹在转录物和蛋白质水平上进行。我们进一步描述了一种使用氧电极来确定光合活性的实验方法，该电极测量蓝藻培养物的分子氧产生率。我们的协议可用于评估 RuBisCO 工程在代谢和生理水平上的影响。 [背景] RuBisCO（核酮糖 1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶）是一种中心酶，参与将大气 CO 2固定到其光合自养生产者的生物质中（Nisbet等人，2007 年；Tabita等人，2008 年；Kacar等人.，2017 年；Erb 和 Zarzycki，2018 年）。提高 RuBisCO 羧化活性的效率可能会增加生物质的产量，并推动具有成本效益、生态友好的方式来生物合成各种碳基化合物（Simkin等人，2019 年；Kubis等人，2019 年）。因此，RuBisCO 已成为研究最广泛和工程化的酶之一（Bainbridge等，1995；Whitney等，2011）。已使用不同的方法来操纵 RuBisCO 的总活性，例如通过激活酶提高其活化（Bhat等人，2017 年），在酶底物结合或活性位点中加入有益的突变（Andersson，2008 年），以及上调 RuBisCO表达（Parry等人，2003 年；Carmo-Silva等人，2015 年；Liang 和 Lindblad，2017 年；Salesse-Smith等人，2018 年；Durall等人，2020 年；Garcia等人，2021 年），以及在基因组上用其古老的对应物替换天然 RuBisCO（Kedzior等人，2021 年）。 通常在转录物和蛋白质水平上评估工程策略对增加 RuBisCO 表达的影响。在这里，我们提出了一个详细的协议，该协议建立和扩展了其他人应用的方法来分析 RuBisCO 在蓝藻中的表达。此处详述的方法允许通过测量工程光合生物的光合活性来评估改变的酶表达的潜在代谢影响。特别是，该协议使用模型蓝藻细长聚球藻PCC 7942（以下简称S. elongatus ），该模型广泛用于基础和应用研究，因为它具有天然能力，并且可以使用标准工程技术轻松修改其基因组（Atsumi等人， 2009 年；塔顿等人，2020 年）。作为修饰的菌株，可以相对于野生型进行评价的例子S.细长（WT）中，我们使用的是港口的天然突变株“Syn02” RBC操纵子和第二复制在染色体中性位点插入，如所描述的并由我们的实验室研究（Garcia等人，2021 年）。 在这里，我们将不同的操作方法信息组合在一个单一的、现成的协议中。此外，我们专门调整了其他地方报道的方法，以提高分离的总 RNA 的目标产量和纯度——这是生成 qPCR 分析中使用的 cDNA 模板所必需的。总体而言，我们在转录水平上对 RuBisCO 表达的分析采用了经过调整的方案，包括不同制造商（QIAGEN、Invitrogen、Applied Biosystems）推荐的方案，以从细菌中提取和纯化总 RNA，逆转录为 cDNA，并通过 qPCR 分析基因表达。具体来说，我们使用参考基因secA对基于先前研究的rbcL表达进行标准化，显示其在S. elongatus 的不同生长条件下稳定表达（Szekeres等人，2014 年；Luo等人，2019 年）。为了分析蛋白质水平的表达，在 Ivleva 和 Golden (2007) 的方法基础上进行了修改，在变性条件下从粗细胞提取物中分离了总蛋白质。含有 100 mM 二硫苏糖醇和 2% (w/v) SDS 的 SDS-PAGE 上样缓冲液被替换为含有 1% (w/v) SDS 的热变性裂解缓冲液，不含还原剂，否则会妨碍对分离的蛋白质进行精确定量。通过冻融循环和玻璃珠进行物理细胞破碎的方法被超声处理取代。基于标准聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质转移方案 (Bio-Rad) 详细阐述了执行蛋白质印迹的程序。最后，一抗 RbcL 抗体的使用说明改编自 Agrisera，总蛋白染色和近红外二抗介导的免疫检测说明由 LI-COR Biosciences 提供。我们的协议能够分离约 5 毫克/毫升的总蛋白质。析氧率测量程序遵循 Oxygraph+ 系统（Hansatech Instruments）的制造商指南，并根据以前的方法（Liang 和 Lindblad，2016 年；De Porcellinis等人，2018 年）对蓝藻培养进行了一些调整。我们还修改了用于分析的蓝藻准备工作（本协议的步骤 E8），以减少氧气测量过程中的波动，从而提高可重复性。图 1说明了本协议中描述的所有主要步骤。 图 1. 本协议中提出的实验步骤示意图