Expression and Purification of the Extracellular Ligand-Binding Domain of the Atrial Natriuretic Peptide (ANP) Receptor: Monovalent Binding with ANP Induces 2:2 Complexes

心钠素 化学 受体 跨膜结构域 2尼泊尔卢比 细胞外 配体(生物化学) 生物化学 结合位点 利钠肽 生物 内科学 内分泌学 医学 心力衰竭
作者
Kunio S. Misono,Natarajan Sivasubramanian,Kathleen L. Berkner,Xiaolun Zhang
出处
期刊:Biochemistry [American Chemical Society]
卷期号:38 (2): 516-523 被引量:40
标识
DOI:10.1021/bi982127v
摘要

The receptor for atrial natriuretic peptide (ANP) is a type-I transmembrane protein containing an extracellular ligand-binding domain, a single transmembrane sequence, an intracellular kinase-homologous domain, and a guanylate cyclase (GCase) domain. Binding of ANP to the extracellular domain causes activation of the GCase domain by an as yet unknown mechanism. To facilitate studies of the receptor structure and signaling mechanism, we have expressed the extracellular ANP-binding domain of rat ANP receptor (NPR-ECD) in a water-soluble form. NPR-ECD was purified to homogeneity by ANP-affinity chromatography. SDS−PAGE gave a single 61-kDa band, which coincided with a radioactive band obtained by photoaffinity-labeling with N4α-azidobenzoyl-125I-ANP(4−28). Edman degradation gave a single amino-terminal sequence expected for the mature protein. Both trifluoromethanesulfonic acid and peptide-N-glycosidase F treatments yielded a 50-kDa band, indicating N-glycosylation. The molecular mass of 57 725 Da determined by mass spectrometry indicates the carbohydrate content at 16%. NPR-ECD bound ANP with an affinity comparable to that of the full-length receptor. The ligand selectivity of NPR-ECD (in the order ANP > brain natriuretic peptide ≫ C-type natriuretic peptide) was also similar to that of the full-length receptor. HPLC gel filtration of NPR-ECD gave a peak with an apparent mass of 74 kDa. Preincubation with ANP generated a new 150-kDa peak with a concomitant decrease of the 74-kDa peak. This shift in peak positions was ANP concentration-dependent and was complete at the NPR-ECD-to-ANP molar ratio of 1:1, indicating equimolar binding. The change in the apparent native molecular weight from 74 to 150 kDa suggests that binding causes dimerization of the NPR-ECD:ANP complex to yield an [NPR-ECD:ANP]2 complex.
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