A preliminary study on the inhibitory effect of gallic acid on the growth of human keloid fibroblasts by the transforming growth factor-β/Sma- and Mad-related proteins signaling pathway

摘要: 【摘要】 目的 研究五倍子酸对瘢痕疙瘩成纤维细胞的形态、增殖、细胞周期、胶原收缩程度及对转化生长因子β(TGF-β)/Sma和Mad相关蛋白(Smads)信号通路的影响,探讨五倍子酸治疗瘢痕疙瘩的作用及机制。方法 2022年8 - 12月在武汉市第一医院皮肤外科获取术中切除的经临床及病理确诊的瘢痕疙瘩组织标本3份,采用组织块培养法进行原代成纤维细胞培养,取第3 ~ 8代细胞进行实验。设置低、中、高剂量五倍子酸组(分别用0.025、0.05、0.1 mg/ml五倍子酸干预细胞)及对照组(仅用含10%胎牛血清的DMEM培养细胞)。培养24、48、72 h后,细胞计数(CCK8)法检测各组细胞增殖活性,三维培养观察胶原收缩情况。按上述分组培养细胞24 h后,在微分干涉倒置荧光显微镜下拍照并使用流式细胞仪分析各组细胞周期变化。使用0.1 mg/ml五倍子酸干预细胞作为实验组(高剂量五倍子酸组),与对照组细胞分别培养24 h后,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定两组TGF-β1、2、3浓度变化,实时荧光定量PCR检测TGF-β1、2、3,Smad2、3、4及α平滑肌肌动蛋白(SMA)mRNA相对表达水平。统计学分析采用t检验、单因素方差分析及两因素方差分析,两两多重比较采用LSD-t检验。结果 与对照组相比,随五倍子酸剂量增加,镜下瘢痕疙瘩成纤维细胞形态发生改变,逐渐出现胞体缩小、细胞间距变大、萎缩、凋亡细胞增多现象。CCK8结果显示,随五倍子酸剂量增加及作用时间延长,细胞增殖活力变化显著(F组别 = 78.31,P < 0.001;F时间 = 4.17,P = 0.037),其中高剂量五倍子酸组24、48、72 h时瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活力均显著低于对照组(均P < 0.05)。三维培养显示,随培养时间延长,各组胶原均发生收缩,但收缩程度不同,对照组胶原明显收缩,各浓度五倍子酸组胶原收缩程度较低;作用24、48、72 h,中、高剂量五倍子酸组胶原收缩指数均显著低于对照组(均P < 0.05)。流式细胞仪检测显示,处理24 h后,低、中、高剂量五倍子酸组细胞凋亡率(38.68% ± 3.05%、41.82% ± 2.19%、43.56% ± 3.58%)均显著高于对照组(12.58% ± 1.56%,均P < 0.001);与对照组相比,中、高剂量五倍子酸组G0/G1期细胞比例显著较低(均P < 0.01),而S期和G2/M期细胞比例则显著较高(均P < 0.05)。ELISA结果显示,高剂量五倍子酸组TGF-β1浓度[(758.58 ± 31.42) pg/ml]显著低于对照组[(1 081.30 ± 44.72) pg/ml,t = 11.81,P <0.001],TGF-β2浓度[(71.05 ± 7.40) pg/ml]与对照组[(76.43 ± 6.51) pg/ml]相比差异无统计学意义(t = 1.09,P = 0.317),而TGF-β3浓度[(5.70 ± 3.87) pg/ml]高于对照组[(0.00 ± 0.00)pg/ml,t = 2.94,P = 0.026]。实时荧光定量PCR显示,与对照组相比,高剂量五倍子酸组TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、α-SMA mRNA表达量均较低(均P < 0.05),TGF-β3 mRNA表达量较高(t = 6.78,P = 0.002),而TGF-β2 mRNA表达量无明显变化(t = 0.05,P = 0.962)。结论 五倍子酸可通过改变瘢痕疙瘩成纤维细胞周期,抑制其增殖,促进其凋亡,改变细胞形态,从而减少瘢痕形成及挛缩,其机制可能与抑制TGF-β/Smads信号通路有关。