Multiplexed CRISPR-Based Nucleic Acid Detection Using a Single Cas Protein

清脆的 多路复用 核酸 计算生物学 化学 分子信标 重组酶聚合酶扩增 多路复用 核糖核酸 DNA 寡核苷酸 基因 聚合酶链反应 生物 遗传学 计算机科学 生物化学 电信
作者
Jinyu Fu,Linghao Zhang,Yanlin Long,Zihe Liu,Geng Meng,Huimin Zhao,Xin Su,Shuobo Shi
出处
期刊:Analytical Chemistry [American Chemical Society]
卷期号:95 (44): 16089-16097 被引量:13
标识
DOI:10.1021/acs.analchem.3c01861
摘要

Thanks to its ease, speed, and sensitivity, CRISPR-based nucleic acid detection has been increasingly explored for molecular diagnostics. However, one of its major limitations is lack of multiplexing capability because the detection relies on the trans-cleavage activity of the Cas protein, which necessitates the use of multiple orthogonal Cas proteins for multiplex detection. Here we report the development of a multiplexed CRISPR-based nucleic acid detection system with single-nucleotide resolution using a single Cas protein (Cas12a). This method, termed as CRISPR-TMSD, integrates the toehold-mediated strand displacement (TMSD) reaction, and the cis-cleavage activity of the Cas protein and multiplexed detection are achieved using a single Cas protein owing to the use of target-specific reporters. A set of computational simulation toolkits was used to design the TMSD reporter, allowing for highly sensitive and specific identification of target sequences. In combination with the recombinase polymerase amplification (RPA), the detection limit can reach as low as 1 copy/μL. As proof of concept, CRISPR-TMSD was subsequently used to detect an oncogenic gene and SARS-CoV-2 RNA with a single-nucleotide resolution. This work represents a conceptually new strategy for designing a CRISPR-based diagnostic system and has great potential to expand the application of CRISPR-based diagnostics.
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