CRISPRi-seq for genome-wide fitness quantification in bacteria

计算生物学 生物 基因组 瓶颈 管道(软件) 协议(科学) 转座子突变 计算机科学 基因 遗传学 转座因子 医学 病理 嵌入式系统 程序设计语言 替代医学
作者
Vincent de Bakker,Xue Liu,Afonso M. Bravo,Jan‐Willem Veening
出处
期刊:Nature Protocols [Springer Nature]
卷期号:17 (2): 252-281 被引量:43
标识
DOI:10.1038/s41596-021-00639-6
摘要

CRISPR interference (CRISPRi) is a powerful tool to link essential and nonessential genes to specific phenotypes and to explore their functions. Here we describe a protocol for CRISPRi screenings to assess genome-wide gene fitness in a single sequencing step (CRISPRi-seq). We demonstrate the use of the protocol in Streptococcus pneumoniae, an important human pathogen; however, the protocol can easily be adapted for use in other organisms. The protocol includes a pipeline for single-guide RNA library design, workflows for pooled CRISPRi library construction, growth assays and sequencing steps, a read analysis tool (2FAST2Q) and instructions for fitness quantification. We describe how to make an IPTG-inducible system with small libraries that are easy to handle and cost-effective and overcome bottleneck issues, which can be a problem when using similar, transposon mutagenesis-based methods. Ultimately, the procedure yields a fitness score per single-guide RNA target for any given growth condition. A genome-wide screening can be finished in 1 week with a constructed library. Data analysis and follow-up confirmation experiments can be completed in another 2-3 weeks.
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