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A Luciferase Reporter Gene System for High-Throughput Screening of γ-Globin Gene Activators

荧光素酶 分子生物学 报告基因 基因 发起人 生物 基因表达 转染 遗传学
作者
Wensheng Xie,Robert Silvers,Michael T. Ouellette,Zining Wu,Quinn Lu,Hu Li,Kathleen Gallagher,Kathy Johnson,Monica N. Montoute
出处
期刊:Methods in molecular biology 卷期号:: 207-226 被引量:6
标识
DOI:10.1007/978-1-4939-3673-1_14
摘要

Luciferase reporter gene assays have long been used for drug discovery due to their high sensitivity and robust signal. A dual reporter gene system contains a gene of interest and a control gene to monitor non-specific effects on gene expression. In our dual luciferase reporter gene system, a synthetic promoter of γ-globin gene was constructed immediately upstream of the firefly luciferase gene, followed downstream by a synthetic β-globin gene promoter in front of the Renilla luciferase gene. A stable cell line with the dual reporter gene was cloned and used for all assay development and HTS work. Due to the low activity of the control Renilla luciferase, only the firefly luciferase activity was further optimized for HTS. Several critical factors, such as cell density, serum concentration, and miniaturization, were optimized using tool compounds to achieve maximum robustness and sensitivity. Using the optimized reporter assay, the HTS campaign was successfully completed and approximately 1000 hits were identified. In this chapter, we also describe strategies to triage hits that non-specifically interfere with firefly luciferase.
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