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Screening of ent-copalyl diphosphate synthase and metabolic engineering to achieve de novo biosynthesis of ent-copalol in Saccharomyces cerevisiae

二萜 甲戊酸途径 生物合成 酿酒酵母 焦磷酸法尼酯 穿心莲 ATP合酶 法尼基二磷酸合酶 代谢工程 焦磷酸香叶基香叶基 穿心莲内酯 生物化学 酵母 化学 生物 预酸化 医学 替代医学 病理
作者
Shan Li,Shuangshuang Luo,Xinran Yin,Xingying Zhao,Xuyang Wang,Song Gao,Sha Xu,Jian Lu,Jingwen Zhou
出处
期刊:Synthetic and Systems Biotechnology [Elsevier]
卷期号:9 (4): 784-792
标识
DOI:10.1016/j.synbio.2024.06.005
摘要

The diterpene ent-copalol is an important precursor to the synthesis of andrographolide and is found only in green chiretta (Andrographis paniculata). De novo biosynthesis of ent-copalol has not been reported, because the catalytic activity of ent-copalyl diphosphate synthase (CPS) is very low in microorganisms. In order to achieve the biosynthesis of ent-copalol, Saccharomyces cerevisiae was selected as the chassis strain, because its endogenous mevalonate pathway and dephosphorylases could provide natural promotion for the synthesis of ent-copalol. The strain capable of synthesizing diterpene geranylgeranyl pyrophosphate was constructed by strengthening the mevalonate pathway genes and weakening the competing pathway. Five full-length ApCPSs were screened by transcriptome sequencing of A. paniculata and ApCPS2 had the best activity and produced ent-CPP exclusively. The peak area of ent-copalol was increased after the ApCPS2 saturation mutation and its configuration was determined by NMR and ESI-MS detection. By appropriately optimizing acetyl-CoA supply and fusion-expressing key enzymes, 35.6 mg/L ent-copalol was generated. In this study, de novo biosynthesis and identification of ent-copalol were achieved and the highest titer ever reported. It provides a platform strain for the further pathway analysis of andrographolide and derivatives and provides a reference for the synthesis of other pharmaceutical intermediates.
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