苦荞细胞色素CYP81家族同源基因FtP450-R4的克隆、分子鉴定及其功能分析

细胞色素P450 （cytochrome P450,CYP450）是高等植物中最大的酶蛋白家族之一,广泛参与植物的次生代谢和抗逆生理.本研究采用同源克隆和cDNA末端快速克隆（rapid-amplification of cDNAends,RACE）技术,获得苦荞（Fagopyrum tataricum） CYP81家族同源基因FtP450-R4 （GenBank登录号：KM271986）.FtP450-R4 cDNA全长1770bp,5＇-UTR为49 bp,3＇-UTR为194bp,ORF为l 527 bp,其ORF序列可编码508个氨基酸残基的蛋白.生物信息学分析表明,FtP450-R4蛋白通过N-端4～24位氨基酸残基定位于内质网,与F3＇H （flavonoid 3＇-hydroxylase）、I2＇H （isoflavone 2＇-hydroxylase）和其他CYP450的同源性在44％～46％之间;多重序列比对显示,FtP450-R4具有CYP450中经典的基序和保守序列,但不含F3＇H的特征基序（GGEK）;系统进化树分析显示,FtP450-R4与拟南芥（Arabidopsis thaliana） CYP81家族和I2＇H聚为一大簇,说明其可能参与苦荞黄酮类化合物的羟化或对逆境胁迫的应答.UV-B、寒冷和干旱均能引起FtP450-R4在苦养子叶中表达量的显著变化,而在胚轴中其表达量变化不显著.利用大肠杆菌（Escherchia coli） BL21 （DE3）菌株对FtP450-R4蛋白进行了可溶性表达,活性鉴定表明,重组FtP450-R4蛋白能以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH）和山奈酚为底物进行酶促反应,具有生物学活性.本研究可为了解CYP450在黄酮合成代谢中的功能,明确苦荞黄酮代谢调控的分子机制提供了基础资料.