Quantitative In Vivo Fluorescence Cross-Correlation Analyses Highlight the Importance of Competitive Effects in the Regulation of Protein-Protein Interactions

体内 MAPK/ERK通路 生物 信号转导 激酶 细胞生物学 蛋白激酶A 体外 细胞外 离解常数 蛋白质-蛋白质相互作用 生物物理学 受体 分子生物学 生物化学 遗传学
作者
Wakako Sadaie,Yoshie Harada,Minoru Matsuda,Kazuhiro Aoki
出处
期刊:Molecular and Cellular Biology [Taylor & Francis]
卷期号:34 (17): 3272-3290 被引量:31
标识
DOI:10.1128/mcb.00087-14
摘要

Computer-assisted simulation is a promising approach for clarifying complicated signaling networks. However, this approach is currently limited by a deficiency of kinetic parameters determined in living cells. To overcome this problem, we applied fluorescence cross-correlation spectrometry (FCCS) to measure dissociation constant (Kd) values of signaling molecule complexes in living cells (in vivo Kd). Among the pairs of fluorescent molecules tested, that of monomerized enhanced green fluorescent protein (mEGFP) and HaloTag-tetramethylrhodamine was most suitable for the measurement of in vivo Kd by FCCS. Using this pair, we determined 22 in vivo Kd values of signaling molecule complexes comprising the epidermal growth factor receptor (EGFR)-Ras-extracellular signal-regulated kinase (ERK) mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway. With these parameters, we developed a kinetic simulation model of the EGFR-Ras-ERK MAP kinase pathway and uncovered a potential role played by stoichiometry in Shc binding to EGFR during the peak activations of Ras, MEK, and ERK. Intriguingly, most of the in vivo Kd values determined in this study were higher than the in vitro Kd values reported previously, suggesting the significance of competitive bindings inside cells. These in vivo Kd values will provide a sound basis for the quantitative understanding of signal transduction.
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