Expression and Purification of Yeast-derived GPCR, Gα and Gβγ Subunits for Structural and Dynamic Studies

In the last several years, as evidence of a surged number of GPCR-G complex structures, the expressions of GPCRs and G proteins for structural biology have achieved tremendous successes, mostly in insect and mammalian cell systems, resulting in more than 370 structures of over 70 GPCRs have been resolved. However, the challenge remains, particularly in the conformational transition and dynamics study area where a much higher quantity of the receptors and G proteins is required even in comparison to X-ray and cryo-EM (5 mg/ml, 3 μl/sample) when NMR spectroscopy (5 mg/ml, 250 μl /sample) is applied. As a result, the expression levels of the insect and mammalian systems are also difficult to meet this demand, not to mention the prohibitive cost of producing GPCRs and G proteins using these systems for a vast majority of laboratories. Therefore, exploration of an effective, affordable, and practical approach with broad applicability is demanded. Pichia pastoris expression system has shown its promise in the GPCR preparation with many merits that other eukaryotic expression systems can’t compete with. GPCRs expressed in this system are inexpensive, easy-to-manipulate, and capable of isotopically labeling. Herein, we present related protocols recently developed and upgraded in our lab, including expressions and purifications of P. pastoris derived GPCR along with Gα and Gβγ proteins. We anticipate that these protocols will advance the conformational transition and dynamics studies of the GPCR and its complexes., [摘要]在过去的几年中，作为GPCR-G复杂结构数量激增的证据，用于结构生物学的GPCR和G蛋白的表达已取得了巨大的成功，主要是在昆虫和哺乳动物细胞系统中，导致了370多个已解决了70多个GPCR的结构。但是，挑战仍然存在，特别是在构象转变和动力学研究领域，即使与X射线和冷冻EM相比（5 mg / ml，3μl /样品），也需要大量的受体和G蛋白。当应用NMR光谱法（5 mg / ml，250μl /样品）时。结果，i的表达水平 nsect和哺乳动物系统也很难满足这一需求，更不用说使用绝大多数系统使用这些系统生产GPCR和G蛋白的成本高昂了。因此，需要探索一种具有广泛适用性的有效，负担得起的实用方法。毕赤酵母表达系统已在GPCR制备中显示出其希望，并具有其他真核表达系统无法比拟的许多优点。在该系统中表达的GPCR价格便宜，易于操作，并且能够进行同位素标记。在此，我们提出最近开发并在我们的实验室升级的相关协议，包括表达和纯化的毕赤酵母衍生GPCR以G沿α和G βγ蛋白。我们预期这些协议将促进GPCR及其复合物的构象转变和动力学研究。[背景] G蛋白偶联受体（GPCR）是最大的膜蛋白家族，在许多（病理）生理活动中起着关键作用。GPCR的或它们的效应物的功能障碍会导致各种病症，包括神经变性疾病，癌症，和慢性炎症（Overington等人，2006） 。虽然超过350层的结构（康格里夫等人，2020 ）ø ˚F超过70 GPCRs在复杂的解决与配体和/或transducins ，我们对如何理解的信令通过受体在配体结合到下游信号传播伙伴仍难以捉摸，部分是由于解析的结构仅反映了这些复合物的动态信号传递过程的静态快照。此外，结构本身的局限性包括柔性域的缺失部分以及许多残留物的侧链信息，而这些残留物在X射线和冷冻-EM光谱学中均无法解析。发展互补性的办法来获取丢失的信息将提供宝贵的见解，拓宽GPCR的连续信号处理的我们的理解和引导我们的药物发现目标具体malfunctional信号。显然，NMR是一种极好的工具，可在不影响静态结构的情况下，以最小的结构功能扰动来询问GPCR及其信号伴侣的构象转变和动力学。在NMR研究中，通常使用野生型或修饰程度最低的构建体，当在模拟生理环境（例如洗涤剂MNG-3，胶束或高密度脂蛋白颗粒）中进行操作时，可以最大程度地反映受体的真实行为（重建后的HDL）系统。NMR研究的特定要求也提出了常规表达系统（如大肠杆菌异源表达系统）的挑战。尽管这是最简单，最有效的系统，但表达的蛋白质（尤其是人类衍生的蛋白质）缺乏翻译后修饰s ，这通常会导致功能丧失。插件ECT细胞如SF9，SF21，或HI5，和哺乳动物表达系统，如HEK293和CHO细胞越来越多地用于结构生物学特别是对于X射线和冷冻电镜分光螺柱IES其中的受体相对少量的小号是需要。然而，用于NMR研究，需要一个大的蛋白质quantit ý沿着同位素标记使得昆虫和哺乳动物系统中挑战第要采用的类型为研究。因此，我们开发了一种基于酵母的表达系统来产生受体，其转导蛋白可以满足这一要求。在这个协议中，我们特别专注于制备GPCR的一个广泛适用的策略，G α和G βγ ，其中，用于GPCR制备该协议进一步升级基于我们以前的出版物（叶等人，2016，2018A和2018B ）有显著提高了生产率。对于g α和G βγ制剂已被纳入本组协议作为用于GPCR-G蛋白复合物的研究的完整体系。在手稿中描述的策略也可应用到其他的信令伙伴如GRKs和β -抑制蛋白。如果需要，也很容易切换到同位素标记。与上述其他系统相比，在巴斯德毕赤酵母系统中表达这些受体和效应子的优势是显而易见的。