Analysis of Gram-negative Bacteria Peptidoglycan by Ultra-performance Liquid Chromatography

Bacteria are surrounded by a protective peptidoglycan cell wall. Provided that this structure and the enzymes involved are the preferred target for our most successful antibiotics, determining its structural and chemical complexity is of the highest interest. Traditionally, high-performance liquid chromatography (HPLC) analyses have been performed, but these methods are very time consuming in terms of sample preparation and chromatographic separation. Here we describe an optimized method for preparation of Gram-negative bacteria peptidoglycan and its subsequent analysis by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). The use of UPLC in peptidoglycan analyses provides a dramatic reduction of the sample volume and hands-on time required and, furthermore, permits in-line mass spectrometry (MS) of the UPLC resolved muropeptides, thus facilitating their identification. This method improves our capability to perform high throughput analysis to better understand the cell-wall biology., [摘要]细菌被保护性肽聚糖细胞壁包围。如果这种结构和涉及的酶是我们最成功的抗生素的首选靶标,那么确定其结构和化学复杂性便是最重要的。传统上,已经进行了高效液相色谱(HPLC)分析,但是这些方法在样品制备和色谱分离方面非常耗时。在这里我们描述了一种优化的制备方法 革兰氏阴性细菌肽聚糖及其随后的超高效液相色谱(UPLC)分析。在肽聚糖分析中使用UPLC可以大大减少所需的样品量和动手时间,此外,还可以对U PLC解析的多肽进行在线质谱(MS),从而有助于对其进行鉴定。这种方法提高了我们执行高通量分析以更好地了解细胞壁生物学的能力。[背景]细菌由肽聚糖(PG)的细胞壁所包围,除了到结构的作用,传达细胞形状和保护细菌免受外部损害,作为抗生物,化学屏障iCal和物理应力。murein囊或PG是细胞壁的主要成分。革兰氏阴性细菌在周质空间中呈现单层(Gan等,2008),而它构成了一个厚的网状结构,在革兰氏阳性细菌中具有多个堆积和交联的层(Pasquina-Lemonche等,2020)。Ť他细胞壁是交联的聚糖链的三维网状结构包围所述电池主体(Glauner等人,1988; Typas 。等人,2011;伊根。等人,2020)。典型的单体亚基由二糖五肽GlcNAc-(β1-4)-MurNAc-L-Ala-D-Glu-(γ)-(二氨基酸)-D-Ala-D-Ala组成,其中内消旋-二氨基庚二酸氨基酸和L-赖氨酸是最普遍的二氨基酸(Glauner等,1988; Vollmer等,2008)。这些单体通过MurNAc-(β1-4)-GlcNAc糖苷键转化为线性聚合物,并且可以通过肽链交联。 细胞壁受到各种酶的修饰,这些修饰会影响其亚基的化学性质,其相对丰度以及细胞壁的结构(Vollmer等,2008)。特定条件下的muropeptide组合物的详细知识是关键是理解到什么程度PG变化影响细菌适应环境挑战,抗菌剂的抗性,免疫调节活性和毒素释放和信令(阿尔瓦雷斯等人,2014;卡瓦和de Pedro,2014; Yadav等,2018)。我们的方法使我们能够以高通量的方式研究遗传扰动对细胞壁组成的影响。此外,结合高通量PG分析和遗传扰动,我们可以探索不同的细胞壁修饰酶的功能。实际上,我们最近研究了A类青霉素结合蛋白(aPBP)如何对大肠杆菌的细胞壁完整性作出贡献(Vigouroux等,2020)。通过组合PG分析,形态分析和单分子跟踪,我们已经证明,主要aPBP PBP1b有助于小号通过修复细胞壁缺陷细胞壁完整性,而杆复杂共治棒状细胞的形状。在这里,我们详细描述了通过液相色谱法对革兰氏阴性菌的葡萄球菌进行分离,muramidase消化和多肽分离的过程。我们还提供一些有关成分和结构分析的一般说明。PG的分离取决于SDS中囊囊的不溶性,这是一种相对容易的方法来获取大量PG,并且依赖于可分裂MurNAc-(β1-4)-的特定酶(村酰胺酶或溶菌酶)的可用性GlcNAc糖苷键将结构结合在一起并分解成单个亚基。下一步需要使用敏感和可靠的方法,以允许对不同的PG亚基进行解析,鉴定和定量。从80年代开始,HPLC就一直用于此目的(Glauner等,1988)。尽管这项技术在当时是一次革命,并且揭示了PG结构和组成中出乎意料的复杂性,但30多年来基本上没有变化。但是,存在三个关键局限性:i)对无机缓冲液的要求,与质谱在线分析不兼容,后者会有助于亚基的鉴定;ii)样品通量非常低,这需要几天的样品制备时间和每个样品几个小时的HPLC运行时间;iii)由于色谱系统的灵敏度相对较低,因此需要大量样品(进样量为100-500 µl)。引入UPLC替代其之前的HPLC可以在不影响数据质量的情况下,极大地减少样品量(100x),同时提高速度(20x)。新系统允许使用新的和改进的材料进行反相色谱分析,包括具有非常小的粒径(在2 µm范围内)的固定相,可以承受很高的压力,提高分离度,速度和灵敏度,这是必不可少的用于高通量分析。我们已经开发出一种新的变革性方法,以克服现有方法的局限性(例如,Desmarais等,2013;Kühner等,2014)。具有UPLC技术基础知识的任何人都可以轻松地将我们的协议i)适应于更频繁使用的UPLC机器;ii)大大减少了样品制备和运行时间,从而每天可处理和分析大量PG样品;iii)与MS兼容,无需事先脱盐步骤就可以收集样品并进行MS分析,甚至可以在与UPLC联用的MS系统中进行分析以更快地鉴定多肽,从而揭示了比以前预期的PG化学复杂性高得多的方法(即鉴定较小的多肽);iv)并且需要更少的样品,这对于体内样品(低样品量)尤为重要。