Role and action mechanism of microRNA-26a targeting EZH2 in ultraviolet A-induced photoaging of human skin fibroblasts

摘要： 【摘要】 目的 探讨长波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化中miRNA-26a的表达情况，以及上调或下调miR-26a表达对全基因组甲基化水平、靶基因组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶2（EZH2）及细胞老化的影响。方法 以10 J/cm2 UVA照射人皮肤成纤维细胞，分别在第0、3、7天提取RNA，实时定量反转录PCR（RT-PCR）检测miR-26a的表达；通过转染miR-26a模拟物（mimic）和miR-26a抑制物（inhibitor）上调或下调miR-26a的表达，通过荧光显微镜观察和实时定量PCR 检测miR-26a表达量，并评估转染效率。将人皮肤成纤维细胞分为空白对照组（不做任何处理）、UVA组（UVA照射）、miR-26a-mimic组（转染miR-26a -mimic）、UVA + miR-26a-mimic组（转染miR-26a-mimic后UVA照射）、miR-26a-inhibitor组（转染miR-26a -inhibitor）、UVA + miR-26a-inhibitor组（转染miR-26a-inhibitor后UVA照射）。第7天完成UVA照射后，收集各组细胞，采用流式细胞仪检测细胞周期，DNA甲基化定量检测试剂盒检测全基因组甲基化水平，RT-PCR检测EZH2、DNA甲基转移酶1（DNMT1）mRNA以及miR-26a的表达，Western 印迹检测EZH2以及DNMT1蛋白的表达。采用单因素方差分析及LSD-t检验进行统计学分析。结果 随着培养时间的延长，对比空白对照组，UVA照射组中miR-26a表达量逐渐增高，在UVA照射第7天后，两组间miR-26a表达水平差异有统计学意义（t = 5.295，P < 0.05）。miR-26a mimic/miR-26a inhibitor转染HSF后，细胞内均有较高的荧光表达，提示均具有较高的转染效率。流式细胞仪检测显示，空白对照组、UVA组、miR-26a-mimic组、UVA + miR-26a-mimic组、miR-26a-inhibitor组、UVA+ miR-26a-inhibitor组G1期细胞比例分别为52.82% ± 2.56%、78.56% ± 4.34%、53.63% ± 3.13%、89.52% ± 4.17%、54.39% ± 3.86%、65.34% ± 4.78%，各组间差异有统计学意义（F = 46.728，P < 0.01），其中UVA组高于空白对照组（t = 8.848，P < 0.01），UVA + miR-26a-mimic高于miR-26a-mimic组（t = 11.922，P < 0.01）和UVA组（t = 3.154，P < 0.05），UVA +miR-26a-inhibitor组高于miR-26a-inhibitor组（t = 3.087，P < 0.05），但低于UVA组（t = 3.547，P < 0.05）。全基因组甲基化水平检测显示，上述各组甲基化水平（A450值）分别为0.676 ± 0.024、0.323 ± 0.043、0.506 ± 0.035、0.169 ± 0.024、0.602 ± 0.036、0.422 ± 0.029，各组间差异有统计学意义（F = 97.402，P < 0.01），其中UVA组低于空白对照组（P < 0.01），UVA + miR-26a-mimic低于miR-26a-mimic组（P < 0.01）和UVA组（P < 0.01），UVA + miR-26a-inhibitor组低于miR-26a-inhibitor组（P < 0.01），但高于UVA组（P < 0.05）。RT-PCR和Western 印迹显示，6组细胞间EZH2、DNMT1 mRNA和蛋白表达水平差异均有统计学意义（均P < 0.05），其中UVA组均低于空白对照组（P < 0.05），UVA + miR-26a mimic组均低于miR-26a mimic组（P < 0.05）和UVA 组（P < 0.05），而UVA + miR-26a inhibitor组均低于miR-26a inhibitor组（P < 0.05），但均高于UVA 组（P < 0.05）。结论 在UVA照射诱导皮肤成纤维细胞光老化中，miR-26a表达上调，细胞增殖活性下降，全基因组甲基化水平降低；上调miR-26a的表达，可下调其靶基因EZH2及甲基化相关基因DMNT1的表达，促进细胞光老化，反之，下调miR-26a的表达，可上调EZH2及DNMT1的表达，抑制细胞光老化。