Genome-wide integration site detection using Cas9 enriched amplification-free long-range sequencing

生物 插入突变 仆从 计算生物学 纳米孔测序 Cas9 基因组 DNA测序 清脆的 基因组编辑 基因组工程 基因 遗传学 全基因组测序 参考基因组 DNA测序器
作者
Joost van Haasteren,Altar M. Munis,Deborah R. Gill,Stephen C. Hyde
出处
期刊:Nucleic Acids Research [Oxford University Press]
卷期号:49 (3): e16-e16 被引量:10
标识
DOI:10.1093/nar/gkaa1152
摘要

Abstract The gene and cell therapy fields are advancing rapidly, with a potential to treat and cure a wide range of diseases, and lentivirus-based gene transfer agents are the vector of choice for many investigators. Early cases of insertional mutagenesis caused by gammaretroviral vectors highlighted that integration site (IS) analysis was a major safety and quality control checkpoint for lentiviral applications. The methods established to detect lentiviral integrations using next-generation sequencing (NGS) are limited by short read length, inadvertent PCR bias, low yield, or lengthy protocols. Here, we describe a new method to sequence IS using Amplification-free Integration Site sequencing (AFIS-Seq). AFIS-Seq is based on amplification-free, Cas9-mediated enrichment of high-molecular-weight chromosomal DNA suitable for long-range Nanopore MinION sequencing. This accessible and low-cost approach generates long reads enabling IS mapping with high certainty within a single day. We demonstrate proof-of-concept by mapping IS of lentiviral vectors in a variety of cell models and report up to 1600-fold enrichment of the signal. This method can be further extended to sequencing of Cas9-mediated integration of genes and to in vivo analysis of IS. AFIS-Seq uses long-read sequencing to facilitate safety evaluation of preclinical lentiviral vector gene therapies by providing IS analysis with improved confidence.
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