Establishment of Duplex SYBR Green I-based Real-time PCR Assay for Simultaneous Detection of Duck Hepatitis A Virus-1 and Duck Astrovirus-3

Duck viral hepatitis (DVH) mainly affects ducklings under 1 month of age, causes liver necrosis, enlargement, and hemorrhage, and is highly lethal, seriously jeopardizing the duck industry. The prevalence of duck hepatitis A virus (DHAV-1) and duck astrovirus type 3 (DAstV-3) is increasing, and coinfection is common. Moreover, the similar clinical characteristics of the DHAV-1 and DAstV-3 infections and the high frequency of coinfection make diagnosis difficult. In this study, to establish a method for the rapid, simultaneous detection of DHAV-1 and DAstV-3, two pairs of specific primers were designed according to their conserved gene regions. An SYBR® Green I-based qPCR assay was successfully established that can quickly and differentially detect the two viruses. Moreover, the assay is highly specific and does not show cross-reaction with other common viruses. The detection limit of the method is 7.34 × 101 copies/µl and 3.78 × 101 copies/µl for DHAV-1 and DAstV-3, respectively, indicating high sensitivity. A total of 34 clinical samples were tested using the established method; the positive rates for DHAV-1 and DAstV-3 were 14.71% and 8.82%, respectively, and that for coinfection was 2.94% (1/34), which was better than that obtained with conventional PCR. In summary, the SYBR Green I-based qPCR assay established in this study has high specificity, good sensitivity and accuracy, high feasibility, and is rapid. Thus, it can be a powerful tool for the coinfection detection of DHAV-1 and DAstV-3 and for future epidemiologic studies.Artículo regular—Establecimiento de un ensayo dúplex de PCR en tiempo real basado en SYBR Green I para la detección simultánea del virus de la hepatitis A del pato-1 y del astrovirus del pato tipo 3. La hepatitis viral del pato (DVH) afecta principalmente a los patitos menores de 1 mes de edad, causa necrosis hepática, agrandamiento y hemorragia, y es altamente letal, lo que pone en grave peligro la industria del pato. La prevalencia del virus de la hepatitis A del pato (DHAV-1) y del astrovirus del pato tipo 3 (DAstV-3) está aumentando y la coinfección es común. Además, las características clínicas similares de las infecciones por el virus de la hepatitis A del pato y el astrovirus del pato tipo 3 así como la alta frecuencia de coinfección dificultan el diagnóstico. En este estudio, para establecer un método para la detección rápida y simultánea por el virus de la hepatitis A del pato y el astrovirus del pato tipo 3, se diseñaron dos pares de iniciadores específicos según sus regiones génicas conservadas. Se estableció con éxito un ensayo cuantitativo de PCR basado en SYBR® Green I que pudo detectar rápida y diferencialmente los dos virus. Además, el ensayo es muy específico y no muestró reacción cruzada con otros virus comunes. El límite de detección del método fue de 7.34 × 101 copias/µl y de 3.78 × 101 copias/µl para el virus de la hepatitis A del pato y para el astrovirus del pato tipo 3, respectivamente, lo que indica una alta sensibilidad. Se analizaron un total de 34 muestras clínicas utilizando el método establecido; las tasas positivas para el virus de la hepatitis A del pato y para el astrovirus del pato tipo 3 fueron del 14.71% y 8.82%, respectivamente y la de coinfección fue del 2.94% (1/34), que fue mejor que la obtenida con el método de PCR convencional. En resumen, el ensayo cuantitativo de PCR basado en SYBR Green I establecido en este estudio tiene alta especificidad, buena sensibilidad y precisión, alta viabilidad y es rápido. Por lo tanto, puede ser una herramienta poderosa para la detección de coinfecciones con el virus de la hepatitis A del pato y astrovirus del pato tipo 3 y para futuros estudios epidemiológicos.