In vivo fluorescent TUNEL detection of single stranded DNA gaps and breaks induced by dnaB helicase mutants in Escherichia coli

回复 生物 DNA损伤 dnaB解旋酶 解旋酶 DNA复制 DNA DNA聚合酶 分子生物学 DNA修复 复制蛋白A 细胞生物学 细菌圆形染色体 遗传学 基因 核糖核酸 DNA结合蛋白 转录因子
作者
Megan S. Behrmann,Michael A. Trakselis
出处
期刊:Methods in Enzymology 卷期号:: 125-142 被引量:4
标识
DOI:10.1016/bs.mie.2022.02.021
摘要

The genome of prokaryotes can be damaged by a variety of endogenous and exogenous factors, including reactive oxygen species, UV exposure, and antibiotics. To better understand these repair processes and the impact they may have on DNA replication, normal genome maintenance processes can be perturbed by removing or editing associated genes and monitoring DNA repair outcomes. In particular, the replisome activities of DNA unwinding by the helicase and DNA synthesis by the polymerase must be tightly coupled to prevent any appreciable single strand DNA (ssDNA) from accumulating and amplifying genomic stress. If decoupled, vulnerable ssDNA would persist, likely leading to double strand breaks (DSBs) or requiring replication restart mechanisms downstream of a stall. In either case, free 3'-OH strands would exist, resulting from ssDNA gaps in the leading strand or complete DSBs. Terminal deoxyribonucleotide transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) can enzymatically label ssDNA ends with bromo-deoxy uridine triphosphate (BrdU) to detect free 3′-OH DNA ends in the E. coli genome. Labeled DNA ends can be detected and quantified using fluorescence microscopy or flow cytometry. This methodology is useful in applications where in situ investigation of DNA damage and repair are of interest, including effects from enzyme mutations or deletions and exposure to various environmental conditions.

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