Entwicklung dünnschichtchromatographischer Analysenverfahren zum Nachweis von Molkenproteinen in Molkenprotein‐angereichertem Schnittkäse

Bei der traditionellen Käseherstellung wird der Großteil der Molkenproteine zusammen mit der Molke abgetrennt. Durch die Entwicklung innovativer Herstellungsverfahren, bspw. der Hocherhitzung eines Teilstroms der Käsereimilch, ist es gelungen Molkenprotein‐ angereicherte Käse zu produzieren. Dies führt zu einer möglichen Optimierung der Wertschöpfung des Rohstoffes Milch. Molkenproteine besitzen aufgrund der schwefelhaltigen und verzweigtkettigen Aminosäuren eine hohe biologische Wertigkeit, sodass eine Molkenproteinanreicherung von Käse auch den ernährungsphysiologischen Wert der Produkte steigern könnte. Bis zum jetzigen Zeitpunkt gibt es allerdings keine validierten Methoden, die eine sichere Quantifizierung des Molkenproteinanteils in Käse erlauben. Die Methoden sind unerlässlich für die Lebensmittelüberwachung, um eine Kennzeichnung dieser neuartigen Produkte zu ermöglichen. Aus diesem Grund war es das Ziel dieser Arbeit Methoden zu entwickeln, die sich zur Quantifizierung des Molkenproteinanteils in Käse eignen. Neben den üblichen Verfahren zur Analyse von Peptiden und Proteinen, wie der Gelelektrophorese (GE) oder der HochleistungsflüssigkeitschromatographieTandemmassenspektrometrie (HPLC‐MS/MS), stellt die Hochleistungsdünnschichtchromatographie (HPTLC) eine geeignete Alternative dar. So kann durch die Verwendung der zweidimensionalen HPTLC (2D‐HPTLC) die vergleichsweise schlechtere Auflösung der eindimensionalen HPTLC (1D‐HPTLC) gesteigert werden. Es wurde anhand von tryptischen Hydrolysaten der fünf abundantesten Milchproteine erstmals die Reproduzierbarkeit der 2D‐HPTLC zur Trennung von Peptiden bestimmt. Darüber hinaus wurden die erhaltenen Peptidmuster charakterisiert. Anschließend wurden für 60% der analysierten Peptidspots die Aminosäuresequenzen mittels MALDI‐TOF‐MS/MS bestimmt. Auf Grundlage dessen wurden statistisch signifikante Korrelationen zwischen den Eigenschaften der Peptide und ihrem Laufverhalten identifiziert. Die höchsten Korrelationsfaktoren wurden für die Abhängigkeit zwischen den x‐ und y‐ Koordinaten und dem prozentualen Gehalt an unpolaren Aminosäuren im Peptid bestimmt. Zusätzlich wurden Regressionsgeraden berechnet, die anhand des prozentualen Gehalts an unpolaren Aminosäuren im Peptid, die späteren x‐ und y‐Koordinaten auf der HPTLC‐Platte vorhersagen. Dies ist nicht nur für Molkenpeptide gelungen, sondern auch für Peptide anderer proteinreicher Lebensmittel (beispielhaft anhand von Erbsenpeptiden), was darauf hindeutet, dass die Methodik für Peptide von unterschiedlichen Proteinursprüngen anwendbar ist. Bei dem Versuch die etablierte 2D‐HPTLC‐Methode auf Käseproben anzuwenden, wurde deutlich, dass sich für eine Quantifizierung des Molkenproteinanteils im Käse lediglich die Methodik des HPTLC‐ Immunostainings eignete. Durch die spezifische Detektion ausgewählter Peptide des β‐Lactoglobulins (β‐LG) mit Antikörpern war es möglich selektiv β‐LG‐Peptide in dem komplexen Gemisch der tryptischen Käseproteinhydrolysate anzufärben. Es konnte ein potenzieller Biomarker mit dem Peptid VYVEELKPTP identifiziert werden, welches sich durch eine gleichbleibende Stabilität während des gesamten Reifungsverlaufs gegenüber der Proteolyse auszeichnete. Darüber hinaus konnte für das Peptid eine lineare Anreicherung im Käse mit zunehmendem Anteil an hocherhitzter Milch in der Käsereimilch nachgewiesen werden. Über eine Ein‐Punkt‐Kalibrierung war es möglich, eine Abschätzung über den prozentualen Gehalt an β‐LG im Käse abzugeben. Für eine Quantifizierung des Molkenproteinanteils im Käse fehlt jedoch noch ein Faktor, der vom Gehalt des Peptidbiomarkers auf den Molkenproteinanteil im Käse schließen lässt.